用于调控靶基因表达的重组ＤＮＡ构建体和方法技术

本发明专利技术提供重组ＤＮＡ构建体和用于通过干扰小ＲＮＡ和其靶基因结合来操纵由小ＲＮＡ调节的靶基因表达的方法。更具体地，本发明专利技术公开了编码用于调节靶基因表达的切割阻断剂、５－修饰的切割阻断剂和翻译抑制剂的重组ＤＮＡ构建体及其使用方法。还公开了可用于设计包含ｍｉＲＮＡ－无应答转基因、ｍｉＲＮＡ诱饵、切割阻断剂、５－修饰切割阻断剂和翻译抑制剂的重组ＤＮＡ构建体的ｍｉＲＮＡ靶标，及其使用方法，以及含有这种构建体的转基因真核细胞和生物体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于调控靶基因表达的重组DNA构建体和方法相关申请的交叉引用以及序列表的合并本申请要求于2008年7月1日申请的美国临时专利申请61/077,244的优先权权益，该申请以引用方式全部并入本文。在2008年6月27日创建并以电子提交方式与美国临时专利申请61/077,244一起于2008年7月1日提交的名称为“38-21_55745_A.txt”的文件中含有的序列表(用操作系统MS-Windows统计为2574千字节)以引用方式全部合并入本文。创建于2009年9月1日并且于2009年9月10日电子提交的名称为“38-2_155745_B_替换.txt”的文件中含有的序列表(用操作系统MS-Windows统计为2611千字节)以引用方式合并入本文。
本专利技术公开了重组DNA构建体，所述构建体具有将加工成RNA的DNA，所述RNA为靶基因转录物提供RNA酶III切割抗性。这种RNA用作可用于调节靶基因表达的切割阻断剂和翻译抑制剂。还公开了miRNA识别位点序列及其在设计重组DNA构建体中的用途，所述重组DNA构建体包括miRNA-无应答转基因、miRNA诱饵(decoy)、切割阻断剂和翻译抑制剂。还公开了在其基因组中含有本专利技术重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子。还公开了利用本专利技术重组DNA构建体来调控靶基因表达的方法。
技术介绍
已经描述了参与RNA介导的基因抑制的若干细胞途径，其各自在特征性途径和具体组成上不同。通常，RNA介导的基因抑制包括在单个RNA分子内形成或在两个RNA分子间形成的双链RNA(dsRNA)中间体。该较长的dsRNA中间体由RNA酶III家族的核糖核酸酶(Dicer或Dicer样核糖核酸酶)加工成一条或多条小双链RNA，其中一条链由核糖核酸酶合并入RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)。认为哪条链合并入RISC中取决于双链小RNA的某种热力学特性，如Schwarzetal.(2003)Cell，115：199-208和Khvorova等(2003)Cell，115：209-216所描写的那些。siRNA途径包括将较长双链RNA中间体非定相切割(non-phasedcleavage)为小干扰RNA(“siRNA”)。认为siRNA的大小是约19至约25个碱基对，但是常见种类的siRNA包括含有21个碱基对至24个碱基对的那些。例如参见Hamilton等(2002)EMBOJ.，21：4671-4679。微RNA途径包括微RNA(“miRNA”)，是通常介于约19至约25个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)之间的非蛋白质编码RNA，其指导靶标转录物的反式切割，负调节参与各种调节和发育途径的基因的表达；参见Ambros等(2003)RNA，9：277-279。天然存在的miRNA由初级转录物(“pri-miRNA”)衍生，该初级转录物天然加工成较短的转录物(“pre-miRNA”)，后者进一步加工成成熟的miRNA。有关植物和动物中的miRNA生物起源的最新综述，可参见Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6：376-385。经由miRNA对生物途径的基因调控可在多种水平以不同方式发生，包括单基因或多基因调控、转录调节剂的调控、选择性剪接的调控；参见Makeyev&Maniatis(2008)Science，319：1789-1790。miRNA、其前体、其识别位点及其启动子的各种应用详细描写在共同转让美国专利申请公布说明书2006/0200878A1中，特别以引用方式合并入本文，其包括：(1)表达天然miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(2)表达工程改造(非天然)的miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(3)表达带有miRNA识别位点的转基因，其中当内源或转基因地表达相应成熟miRNA时，该转基因被抑制；以及(4)表达由miRNA启动子驱动的转基因。在反式作用siRNA(“ta-siRNA”)途径中，miRNA的作用是在需要RNA依赖性RNA聚合酶来产生双链RNA前体的过程中指导siRNA初级转录物的同步加工；反式作用siRNA定义为缺乏二级结构，缺乏启动双链RNA产生的miRNA靶位点，需要DCL4和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)并产生多个完美定相的～21-nt小RNA，其具有含2个核苷酸的3’突出端的完美匹配的双链体(参见Allen等(2005)Cell，121：207-221；Vazquez等(2004)Mol.Cell，16：69-79)。定相小RNA(“phasedsRNA”)途径(参见PCT专利申请PCT/US2007/019283，以WO2008/027592公开)基于称为“定相小RNA基因座”的内源基因座，其转录为形成单一折回结构的RNA转录物，所述结构在体内定相切割成多个能够抑制靶基因的小双链RNA(称为“定相小RNA”)。和siRNA相反，定相小RNA转录物是定相切割的。和miRNA相反，定相小RNA转录物被DCL4或DCL4样直向同源核糖核酸酶(非DCL1)切割成多个大量的能够沉默靶基因的小RNA。和ta-siRNA途径相反，定相小RNA基因座转录为RNA转录物，该RNA转录物形成与RNA依赖性RNA聚合酶无关的杂交RNA，且不带有启动双链RNA生成的miRNA靶位点。据报道，由加工自天然反义转录物的小RNA介导的基因抑制有至少两种途径。在天然反义转录物小干扰RNA(“nat-siRNA”)途径(Borsani等(2005)Cell，123：1279-1291)中，siRNA由DCL1切割在一对基因的反义转录物(顺式-反义基因对)之间形成的双链RNA而生成。没有报道类似的天然反义转录物微RNA(“nat-miRNA”)途径(Lu等(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105：4951-4956)。在多细胞动物中，据报道称为Piwi-相互作用RNAs(“piRNAs”)的小RNA也具有沉默基因活性(Lau等(2006)Science，313：363-367；O’Donnell&Boeke(2007)Cell，129：37-44)。专利技术简述一方面，本专利技术提供重组DNA构建体，其含有将加工成RNA的DNA，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性。本专利技术的另一方面提供编码“切割阻断剂”的重组DNA构建体，所述“切割阻断剂”用于抑制双链RNA介导的至少一个靶基因的抑制，从而增加靶基因的表达(相对于不存在切割阻断剂时的表达)。一种实施方式是含有将加工成RNA的DNA的重组DNA构建体，所述RNA含有单链RNA，该单链RNA和至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的RNA的杂交片段，该片段使得所述转录物对杂交片段内或其附近的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中单链RNA和转录物的结合(以及杂交片段的最终形成)抑制双链RNA介导的至少一个靶基因的抑制。本专利技术的另一方面提供编码“5’-修饰的切割阻断剂”本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．转基因植物细胞中的重组ＤＮＡ构建体，其含有在所述转基因植物细胞中表达并将加工成ＲＮＡ的ＤＮＡ，所述ＲＮＡ含有单链ＲＮＡ，该单链ＲＮＡ和所述转基因植物细胞中的至少一个靶基因的转录物结合以形成至少部分双链的ＲＮＡ的杂交片段，该片段使得所述转录物对所述杂交片段内或其附近的ＲＮＡ酶ＩＩＩ核糖核酸酶的切割具有抗性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/077,2442008年7月1日1.转基因植物细胞中的重组DNA构建体，其含有在所述转基因植物细胞中表达并将加工成第一RNA的DNA，所述第一RNA含有单链RNA，该单链RNA在第二RNA的miRNA识别位点处结合所述第二RNA，其中所述第二RNA是所述转基因植物细胞中的至少一个靶基因的转录物，其中至少部分双链的RNA的杂交片段至少部分形成于所述miRNA识别位点内，从而阻止正常识别所述miRNA识别位点的成熟miRNA与所述miRNA识别位点结合并使得所述转录物对在所述miRNA识别位点内的RNA酶III核糖核酸酶的切割具有抗性，其中所述杂交片段包含：a.在所述单链RNA和所述miRNA识别位点之间在对应于所述成熟miRNA的位置9、10或11的位置上的至少一个错配，或b.在所述单链RNA中在对应于所述成熟miRNA的位置10-11的位置上的至少一个插入，或c.在所述单链RNA中在对应于所述成熟miRNA的5’端的位置上由U突变为A、G或C，但不包含(i)所述单链RNA和所述miRNA识别位点之...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·I·埃瓦舒塔，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：US