偶联的Ｖｉ糖制造技术

采用己二酸二酰肼衍生ＣＲＭ１９７（白喉毒素的无毒变体）和破伤风类毒素作为载体蛋白，通过碳二亚胺介导的合成反应制备两种Ｖｉ偶联物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及疫苗，更具体涉及针对伤寒的疫苗。
技术介绍
伤寒是一种在全世界很多地方常见的严重疾病。将来自伤寒沙门菌(Salmonella typhi)的纯化荚膜多糖(Vi)用作疫苗，在5-45岁的个体中提供约70%针对伤寒的保护作 用。然而，该疫苗不能建立免疫记忆，且在婴儿或幼童中无效。与重组突变的铜绿假单 胞菌O^seudomonas aeruginosa)胞外蛋白A偶联的Vi偶联疫苗(Vi-rEPA)在年幼儿童中 引起加强应答，具有高度有效性。本专利技术的目的是提供可在工业规模上使用的生产Vi偶联疫苗的新方法。
技术实现思路
专利技术者设计了制备Vi偶联物的新方法，并生产了包含与CRM197偶联的Vi的新偶 联物。本专利技术的第一方面提供制备Vi偶联物的方法。同时将接头如己二酸二酰胼(ADH) 和碳二亚胺如1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)加入包含载体蛋白如CRM197 或破伤风类毒素(TT)的溶液中，以产生衍生化载体蛋白。可在加入ADH和EDAC前将缓冲液如2_ (N-吗啉代)乙磺酸(MEQ加入包含所述 载体蛋白的溶液中。碳二亚胺与蛋白质的重量比通常是0. 1-0. 15，因为更高的碳二亚胺/ 蛋白质比率可导致聚集体形成。所述载体蛋白衍生化后，通过例如透析或切向流过滤(TFF)去除任何过量的接头 (例如ADH)。同样用碳二亚胺激活Vi，随后将其与衍生化载体蛋白结合。可将各种比率的Vi和 碳二亚胺用来激活Vi。可采用1 1的摩尔比(Vi的COOH基和碳二亚胺的比率)，但为降低 未偶联碳二亚胺衍生物(例如脲，如EDU、EDAC偶联的可溶性反应产物N-乙基-N' -(3-二 甲基氨基丙基)脲)的残留量，可采用更高的比率，即摩尔过量的Vi，例如>1.5 1，理想 为彡3 1，如3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、8 1、9 1或更高。可采用的最高比率 为200 1。这些比率高于参考文献3采用的比率。可在室温下例如约2分钟内激活Vi。因此，所述方法包括以下步骤a)同时将接头、碳二亚胺和载体蛋白结合。b)使Vi与碳二亚胺反应。c)使步骤a)的产物与步骤b)的产物反应。步骤a)和b)可以任何顺序进行。可在步骤a)后但步骤C)前去除任何过量的接头。本专利技术的该方面还提供制备Vi-CRM197偶联物的方法，其中Vi与衍生化CRM197结 合。所述方法包括以下步骤a)使Vi与碳二亚胺反应。b)使步骤a)的产物与衍生化CRM197反应。本专利技术的该方面还提供制备Vi-CRM197偶联物的方法，其包括以下步骤a)使活化Vi与衍生化CRM197反应。参考文献3描述了通过以ADH为接头的碳二亚胺介导的合成反应制备Vi与rEPA 和牛血清白蛋白(BSA)的偶联物的方法。然而，该方法不包括将rEPA/BSA、ADH和EDAC同 时结合。而是在加入EDAC前将rEPA/BSA与ADH结合并混合。本专利技术的第二方面提供Vi-CRM197偶联物。可通过以上方法制备该偶联物，或可通 过其它手段获得。Vi 糖Vi是伤寒沙门菌(先前本身分类为一个种，现在称为肠道沙门菌(S.enterica) 的伤寒血清型(serovar))的荚膜糖。也可在沙门菌的其它血清型(如肠道沙门菌的丙 型副伤寒(paratyphi C)血清型或都柏林(dublin)血清型)和其它细菌如柠檬酸杆菌属 (CitrcAacter)(例如，弗氏柠檬酸杆菌(C. freundii)和杨氏柠檬酸杆菌(C. youngae))中 发现Vi。所述Vi多糖是氨基己糖醛酸，C-3位置60-90%乙酰化的α 1，4_Ν_乙酰氨基半 乳糖醛酸的线型均聚物。Vi上的0-乙酰取代是其引发保护性免疫应答的能力因素 。Vi的免疫原性与其0-乙酰化的程度密切相关。部分去-0-乙酰化可略微增加免疫 原性，完全去-O-乙酰化会消除Vi的免疫原性。相对于天然情况下发现的荚膜糖，可化学修饰用于本专利技术的Vi糖。例如，所述Vi 糖可部分去-0-乙酰化、去-N-乙酰化(部分或全部)、Ν-丙酰化(部分或全部)等。可在 偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但优选在偶联前进行。可通过常规试验评价去乙酰化 等的效果。所述Vi糖可水解形成缩短的多糖(例如聚合度(DP)至少为10，例如20、30、40、 50、60或更大)或寡糖(例如聚合度为2-10)。相对多糖，优选将寡糖用于疫苗。可通过离 子交换色谱或比色试验方便地测定所述平均聚合度。此外，通过免疫双扩散已发现，果胶在C-2和C-3发生0-乙酰化时与Vi抗原性相 同。Vi结构与果胶结构的不同之处在于Vi在C-2发生N-乙酰化、在C-3发生0-乙酰化。 与破伤风类毒素偶联的0-乙酰化果胶在小鼠中引发Vi抗体，再注射引发加强应答。相应地，可将0-乙酰化果胶用于本专利技术中取代Vi。然而，Vi偶联物已显示免疫原性 显著大于其0-乙酰化果胶类似物，因此优选天然来源的Vi 。然而，应理解，提及“Vi” 可包括“0-乙酰化果胶”和可能与Vi结构或抗原性相同并能引发识别天然Vi的抗体的任 何其它分子。“Vi”可指Vi多糖(例如聚合度(DP)至少为10，例如20、30、40、50、60或更大)或Vi寡糖(例如聚合度为2-10)，可经化学修饰。寡糖可以是母体多糖解聚和/或水解的结果。Vi 纯化可通过已知技术纯化荚膜糖，如本文引用的参考文献所述。典型的方法包括碱提 取、离心、过滤、RNA酶/DNA酶处理、蛋白酶处理、浓缩、尺寸排阻色谱、超滤、阴离子交换色 谱和进一步超滤。参考文献15公开了一种特别有用的方法，其通过引用纳入本文。纯化Vi的方法可包括以下步骤(a)沉淀Vi，之后(b)采用醇如乙醇溶解沉淀的 Vi。沉淀和醇溶解沉淀可溶性多糖如Vi的很多技术均为本领域已知。优选的方法使用一种或多种 阳离子去污剂。所述去污剂优选具有以下通式权利要求1.一种生产Vi偶联物的方法，其包括以下步骤a)同时将接头、碳二亚胺和载体蛋白结合；b)从步骤a)的产物中去除任何过量的接头；c)使Vi与碳二亚胺反应；和d)使步骤b)的产物与步骤c)的产物反应。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过透析去除所述过量接头。3.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白是CRM197或破伤风4.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述碳二亚胺是1-乙基-3(3-二 甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)。5.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述接头是己二酸二酰胼。6.一种包含与CRM197连接的Vi的偶联物。7.如权利要求6所述的偶联物，其特征在于，所述Vi通过己二酸二酰胼(ADH)接头与 CRM197 连接。8.一种包含如权利要求6或7所述的偶联物的药物组合物，所述偶联物与药学上可接 受的载体结合。9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物不含佐剂。10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。11.如权利要求8或10中任一项所述的组合物，其包含盐水。12.如权利要求8-11中任一项所述的组合物，其特征在于，单位剂量的所述组合物包 含5yg Vi糖。13.—种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括将如权利要求本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产Ｖｉ偶联物的方法，其包括以下步骤：ａ）同时将接头、碳二亚胺和载体蛋白结合；ｂ）从步骤ａ）的产物中去除任何过量的接头；ｃ）使Ｖｉ与碳二亚胺反应；和ｄ）使步骤ｂ）的产物与步骤ｃ）的产物反应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·米可利，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：CH