通过本发明专利技术，可以提供如下方法：通过在ｐＨ６．５～９．０下，将失去了高级结构的蛋白质和月桂酰谷氨酸等特定表面活性剂的１～３％水溶液相接触，得到该蛋白质的可溶化液，将得到的可溶化液加入含有０．１～１．２Ｍ的精氨酸或精氨酸衍生物的ｐＨ６．５～９．０的缓冲液中，通过使得到的混合液中的月桂酰谷氨酸等特定表面活性剂降低至０．０２～０．２７５％，生产恢复了天然状态的高级结构的蛋白质。通过本发明专利技术，可以在将表面活性剂平稳地从蛋白质上脱离的同时，能够简便地恢复蛋白质中的天然状态的高级结构。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在因为经不溶化处理的或是失去了高级结构而失去了活性和稳定性 的蛋白质中恢复天然状态的高级结构的方法(重折叠方法)。
技术介绍
使用大肠菌等作为生产宿主来生产基因重组蛋白质，得到在水中不溶性变性的蛋 白质。这样的蛋白质也叫做变性蛋白质。因为变性蛋白质失去了活性和稳定性，故在将此 蛋白质作为医药品等使用时，必须进行引导以使其具有天然状态的高级结构。已知蛋白质 的重折叠方法可以作为在此种场合下使用的方法。但是，因为在此重折叠中使用的试剂和操作方法，必须根据蛋白质进行适当地选 择，故对没有重折叠经验的操作人员来说并非可以简单地实施的技术。此外，即使是具有充 足的经验，在蛋白质具有复杂的高级结构，在重折叠过程中易引起缔合·凝集的情况下，也 不能容易地得到天然状态。为了解决这些问题，提出了一系列新的重折叠方法。例如，到目前为止有报告使 用色谱柱来降低缔合凝集风险的柱重折叠法(非专利文献1)；将目的物固定在载体上来抑 制缔合凝集的固定化重折叠法(非专利文献幻；使用酸性和碱性缓冲液来代替变性剂，以 部分变性状态而可溶化的PH提取法(非专利文献幻；和分子伴侣共存的方法(非专利文 献4)；将反胶束以分子伴侣样使用的方法(非专利文献幻；利用表面活性剂的胶束的方法 (非专利文献6)；在超过3000个大气压的超高压下不使用变性剂而进行提取的高压重折叠 法(非专利文献7)；以及这些方法的并用法或变形法。这些方法中最令人注目的技术就是，将变性剂提取后的蛋白质用含有表面活性剂 的缓冲液稀释而抑制缔合凝集并同时部分地恢复结构，在下一步中使用环糊精等的表面活 性剂结合剂强行地使表面活性剂从蛋白质中脱离出来而完成结构形成的多段式重折叠法 的“人工分子伴侣系”。此技术的长处是，基本不必进行试错实验，仅需依照已确定的方法探 索几种条件，在效果上可以抑制作为最深刻的问题的缔合凝集。有使用此技术而成功重折 叠的例子的报告，也对此方法的变法进行了后续的研究(非专利文献8)。但是，随着人工分子伴侣系的适用例的增加，我们知道，将添加的表面活性剂从蛋 白质中脱离并不像报告的那样简单，为了发现适当的操作条件，依然需要繁杂的实验。此 外，也有人诟病，多阶段操作引起步骤的繁杂而在工业生产的利用上引起了限制(非专利 文献9)。这样，即使是评价最高的人工分子伴侣系，对于没有经验的工作人员来说，作为容 易且有效的对蛋白质进行重折叠的方法来说也不是十分合适的。另一方面，已知有使用酰化肌氨酸而使蛋白质重折叠的方法，但酰化肌氨酸唯有 在稀释后才能从蛋白质上脱离，如果不用特殊的方法除去，就不能恢复蛋白质的天然状态 的高级结构(非专利文献10，专利文献1)。已知也有使用强碱调节的含有月桂酰-L-谷 氨酸的表面活性剂溶液来使不溶性牛生长激素可溶化，通过超滤法降低表面活性剂浓度而4重折叠的方法(专利文献幻，但此种方法难于有效地恢复生长激素以外的蛋白质的天然状 态。此外，使蛋白质和高强度的碱性PH相接触会在蛋白质中引起不能修复的脱酰胺反应等化学变化。EP 0263902 AUS专利6410694A. Jungbauer, W. Kaar, R. Schlegl Current opinion in Biotechnology 15,487-494(2004)M Matsubara, et al. =FEBS LETT.，342，193-196(1994) S. M-Singh and Α. K. Panda Journal of Bioscience and Bioengineering 99,303-310(2005)D. Rozeman and S. H. Gellman Journal of Biological Chemistry 271,3478-3487(1996) A. J. Hagen, Τ. A. Hatton, and D. I. C. Wang =Biotechnol Bioeng. 35,955-965(1990)G. Zardeneta and P. H. Horowitz :Analytical Biochemistry 223，1-6(1994)Μ. B. Seefeldt, Y. S. Kim, J. Carpenter, T. W. Randolph =Protein Science 14，2258-2266 (2005) S. Machida, S. Ogawa, S. Xiaohua, T. Takaha, K. Fujii，K. Hayashi FEBS Lett. 486,131-135(2000)H. Lanckriet and Α. P. J. Middelberg biotechnology Progress 20，1861-1867(2004)Richard Burgess =Methods in Enzymology. 273,145-149 (1996)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题因此，本专利技术的目的在于提供在平稳地将表面活性剂从蛋白质上脱离的同时，恢 复蛋白质的天然状态的高级结构的简单的重折叠方法。解决课题的手段本专利技术者们通过深入研究，结果发现只要使用特定的表面活性剂水溶液使变性蛋 白质可溶化，将此可溶化液稀释于含有精氨酸和精氨酸衍生物的缓冲液中，就可以在将特 定的表面活性剂从变性蛋白质上脱离的同时恢复该变性蛋白质的高级结构。S卩，本专利技术提供了由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质生产恢复了天然 状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序。(1)通过在pH6. 5 9. 0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触选 自具有C8 C16酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三 甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0.05 1.2M的精氨酸或精氨酸衍生物 的pH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0. 02 0. 5%的工序，(3)回收恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的工序。此外，本专利技术提供了使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质恢复其天然状 态的高级结构的方法，所述方法包含下述工序，(1)通过在pH6. 5 9. 0下，使经不溶化处理或失去了高级结构的蛋白质接触选自 具有C8 C16的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三 甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，(2)通过将得到的可溶化液加入含有0. 05 1. 2M的精氨酸或精氨酸衍生物 的pH6. 5 9. 0的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至0. 02 0. 5%的工序。此外，本专利技术提供了由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质得到恢复其天 然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序(1)通过在pH6. 5 9. 0下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触月 桂酰谷氨酸、月桂酰天冬氨酸或月桂酰亚氨二醋酸的1 3%水溶液，得到该蛋白质的可溶 化液的工序，(2)通过将得到的可本文档来自技高网...
【技术保护点】
由经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质制造恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的方法，所述方法包含下述工序：（１）通过在ｐＨ６．５～９．０下，使经不溶化处理的或失去了高级结构的蛋白质接触选自具有Ｃ８～Ｃ１６的酰基的二羧酸、癸酰肌氨酸、癸酰丙氨酸、癸酸或者它们的盐、氯化月桂基三甲基铵及它们的混合物的表面活性剂的１～３％水溶液，得到该蛋白质的可溶化液的工序，（２）通过将得到的可溶化液加入含有０．０５～１．２Ｍ的精氨酸或精氨酸衍生物的ｐＨ６．５～９．０的缓冲液中，使得到的混合液中的前述表面活性剂的浓度降低至０．０２～０．５％的工序，（３）回收恢复了天然状态的高级结构的蛋白质的工序。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：弓冈良辅，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。