制备型等电点电泳分离方法及设备技术

本发明专利技术涉及一种用于分离蛋白质不同组分的制备型等电点泳分离方法和分离设备，属生物化工技术领域。本方法是在二个平行的窄长电极之间，沿长度方向设置凝胶膜，将电极间的空间分成中间的分离室和两侧的冲洗室。分离室中通入ｐＨ调至目标产品等电点（ｐＩ值）的待分离样品液，冲洗室中通入ｐＨ为目标产品等电点普通缓冲液，在电场作用下等电点与目标产品相异的杂蛋白迁移入两侧的冲洗室而被洗出，从而实现了分离。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于分离两性生物物质(如蛋白质、多肽)的制备型等电点电泳分离方法，属于生物化工
在已有技术中，有一种多腔室的等电聚焦装置，名称为“多腔室电泳装置中的等电聚焦”，出自一篇由玛茨·乔纳森(Mats.Jonsson)和哈里·黎泊(Harry.Rilbe)所写的名为“Large-scale fracitionationof proteins by isoelectric focusing in a multi-compartment electrolysisapparatus”的论文，发表于《电泳》杂志1980年第一期第3页到第14页(Electrophoresis，1，P3-14(1980))。该技术利用载体两性电解质溶液形成的连续的pH梯度场为背景，蛋白质根据各自等电点的不同在相应的pH背景下聚焦而得以分离，并提出了相应的分离设备。其核心部分为一个长圆柱形电泳槽，由相隔一定间距的隔膜将其分隔为数十个腔室，如附图一所示分离前，将载体两性电解质溶液与待分蛋白质样品均匀混合后注入各腔室中；分离时，在电泳槽的两端加直流电压，载体两性电解质在电场作用下发生电迁移，形成由正极到负极pH值逐渐升高的梯度，蛋白质在相异于其等电点的pH环境中不能保持电中性，因而在电场作用下发生电泳迁移，穿过隔膜，在相当于其等电点的pH值的腔室中聚焦，电泳产生的热量通过一套复杂的内循环冷却系统带走，这样经过相当长的时间(2-3天)后，聚焦结束，具有不同等电点的蛋白相互分开在不同的腔室中；最后打开各腔室的样品出口，分别收集样品液，在某一个或与之相邻的几个腔室中就得到纯化了的目标蛋白质组分。该技术的缺点是(1)需要大量价格昂贵的载体两性电解质，另外在后续处理中还需通过透析等方法除去目标组分样品中混杂的载体两性电解质，使分离的成本很高；(2)由于蛋白质的迁移距离很长，电极间距大，而提高场强又受到装置的换热能力的限制，造成该法分离时间过长，处理量较低。在已有技术中，还有一种多腔室的循环流动等电聚焦装置，名称为“使用非载体两性电解质缓冲剂的等电聚焦”，出自一篇由皮埃尔·温格尔(Pierre.Wenger)和菲里蒲·杰夫特(Philippe.Javet)所写的名为“Isoelectric focusing using non-amphoteric buffers in freesolutionII.Apparatus and measures of pH stability”的论文，发表于《生物化学和生物物理方法》杂志1986年第13期第275页到第287页(Journal of Biochemical and Biophysical Methods，13，P275-287(1986))。该技术采用多腔室的循环流动的形式，利用简单缓冲液(不含载体两性电解质)在电场作用下形成的pH梯度作为等电聚焦的背景，用以分离氨基酸和蛋白质，并提出了相应的分离设备。如附图二所示1 为一个多腔室的电泳槽，2 为织物支撑的琼脂糖凝胶膜，3为离子交换膜，4 为换热器，5 为电极液贮槽，6 为缓冲液贮槽。凝胶膜和离子交换膜将电泳槽分隔成相互平行的若干腔室和二个电极室，在电极室中通入电极液，中间的各腔室中通入醋酸—醋酸钠缓冲液，电极液和缓冲液都在相互独立的通路中循环，在电泳槽的两侧加载直流电压，在电场作用下，缓冲液中的一部分离子发生电泳迁移，通过凝胶膜和离子交换膜进入邻近的腔室，经过一段时间后，各腔室的pH值发生变化，形成从阴极到阳极逐渐升高的pH梯度，并使用此pH梯度作为等电聚焦的背景。该技术的缺点是(1)形成的pH梯度不够稳定，各腔室的pH值容易发生漂移，很难用简便的方法校正每一个腔室的pH值；(2)其分离精度的提高受腔室数目的制约，过多的腔室数目将给操作带来极大的不便，所以只能用于粗分，难以分离等电点接近的样品。本专利技术的目的是提出一种新型电泳分离方法，应用等电聚焦的原理，使用简单缓冲液来形成一个稳定的单一pH值，而不是一个稳定的pH梯度作为分离的背景，其目的是分离一个目标产品而不是一系列产品。本专利技术的目的是这样实现的在垂直放置的二个相互平行的窄长电极之间，沿电极的长度方向平行设置二张到四张凝胶膜，它们将电极之间的空间分隔成三到五个相互平行的腔室，中间的腔室为分离室，分离室的两侧为冲洗室，分离进行时，分离室内通入pH值调至目标蛋白质的等电点(pI值)的待分离的样品液，两侧冲洗室中通入pH值等于目标蛋白质等电点且电导小的缓冲液，两电极之间加载恒定的直流电压。下面结合附图，详细介绍本专利技术的内容。附图三是制备型等电点电泳分离方法原理图。图中7为电极，8为凝胶膜，9为通入的样品液，9a为分离室，10为通入的缓冲液，10a为冲洗室，11为目标蛋白质，12为等电点(pI值)大于目标蛋白质的等电点的杂蛋白，13为等电点(pI值)小于目标蛋白质的等电点的杂蛋白。其分离过程是分离室9a通入pH值调至目标蛋白质的等电点(pI值)的待分离的样品液，冲洗室10a通入pH值等于目标蛋白质等电点的缓冲液，两电极7之间加载恒定的直流电压。在这样的pH值条件下目标蛋白质分子11(附图三中以小园圈表示)总体上呈电中性，因此在电场作用下不发生电泳迁移；而其它等电点与目标蛋白有差别的杂蛋白在此条件下则带正电荷或负电荷，等电点(pI值)大的蛋白12带正电(附图三中以三角形表示)，等电点小的蛋白13带负电(附图三中以小黑方块表示)，在电场作用下，必然发生电泳迁移，它们分别穿过分离室两侧的凝胶膜进入两侧冲洗室，从而实现了与目标蛋白质的相互分离。本专利技术的目的也可以这样实现在垂直放置的二个相互平行的窄长电极之间，沿电极的长度方向平行设置二张凝胶膜，在凝胶膜的外侧设置二张离子交换膜，从而将电极之间的空间分隔成五个相互平行的腔室，中间腔室为分离室，与分离室相邻的两个腔室为冲洗室，靠近电极的两个腔室为电极室，分离进行时，分离室内通入pH值调至目标蛋白质的等电点的待分离的样品液，两侧冲洗室中通入pH值等于目标蛋白质等电点且电导小的缓冲液，电极室内通入电极液，两电极之间加载恒定的直流电压。本专利技术使用普通缓冲液，如三羟甲基氨基甲烷—廿氨酸、三羟甲基氨基甲烷—醋酸、醋酸—醋酸钠等，浓度为0.005-0.1摩尔/升；分离室的流速为100-1000毫升/小时，冲洗室的流速为200-2000毫升/小时；所用的凝胶膜的厚度为0.2-2毫米；电极之间的电压为20-500伏，电流强度不高于100毫安，在此范围内，可以适当调整电极电压。在本专利技术原理的基础上，设计了制备型等电点电泳的设备，其核心部分都为电泳槽。附图四是制备型等电点电泳的三腔室电泳槽的装配示意图。上图为平视图，下图为顶视图，图中14为分离室，15为冲洗室，16为分离室腔室框，17为冲洗室腔室体，18为凝胶膜，19为导管，20为用有机玻璃粘制而成的夹紧装置，21为电源插座，22为用来固定腔室体的六角螺栓。四个螺栓用来固定腔室体17、腔室框16和凝胶膜18以围成三个四周封闭的腔室，中间为分离室14，两侧为冲洗室15，分离室和冲洗室上下都有供样品液和缓冲液出入的导管，铂丝电极放在冲洗室内，并与电源插座连接，电泳槽易于拆卸和组装，以便于更换凝胶膜和加装组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备型的等电点电泳分离方法，其特征在于在垂直放置的两个窄长电极之间，沿电极的长度方向平行设置二张至四张凝胶膜，它们将电极之间的空间分隔成三至五个互相平行的腔室，以中间的腔室为分离室，分离室的两侧为冲洗室，分离进行时，分离室内通入ｐＨ值调至目标蛋白质的等电点（ｐＩ值）的待分离样品液，两侧冲洗室中通入ｐＨ值等于目标蛋白质等电点且电导小的缓冲液，两电极之间加载恒定的直流电压。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备型的等电点电泳分离的电泳槽，其特征是在电泳槽的腔室体内，垂直设置两个窄长的电极；在所述的两个电极之间，沿电极长度方向平行设置凝胶膜；所述的凝胶膜将所述电极之间的空间分隔成几个相互平行的腔室，中间的腔室为分离室，在分离室内，通入pH值调至目标蛋白质的等电点的待分离样品液；在分离室的两侧为冲洗室，在冲洗室内，通入pH值等于目标蛋白质等电点且电导小的缓冲液；在所述的两电极之间，加载恒定的直流电压，电极所在的腔室，为阴(阳)极室。2.按权利要求1的电泳槽，其特征是在凝胶膜的外侧，设置离子交换膜，从而将电极之间的空间分隔成相互平行的腔室，中间腔室为分离室，与分离室相邻的两个腔室为冲洗室，靠近电极的两个腔室为电极室(阴或阳极室)。3.按权利要求1或2的电泳槽，其特征是所述的凝胶膜为2～4张，其每张的厚度为0.2～2毫米。4.按权利要求2的电泳槽，其特征是等离子交换膜为阴离子交换膜和/或阳离子交换膜。5.按权利要求1或2的电泳槽，其特征是腔室为3～5个。6.一种制备型的等电点电泳分离方法，其特征是利用权利要求1～4之一的电泳槽，该方法包括如下步骤(1)将pH值调至目...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱德权，丁富新，袁乃驹，刘铮，黄正，张春洁，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]