用于评价和比较免疫组库的方法技术

本发明专利技术公开了一种方法，该方法扩增来自免疫细胞群的ＲＮＡ和／或ＤＮＡ，使用扩增的产物以产生免疫应答谱和评价正常或异常免疫应答与诸如自身免疫性疾病、癌症、糖尿病或心脏疾病的疾病的发生之间的可能的相关性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求于2008年4月16日申请的美国临时专利申请号61/045，586的优选 权权益。专利
本专利技术涉及鉴定生物标志物的方法，和鉴定细胞群中T细胞受体、抗体和MHC重排 的方法。专利技术背景许多年来，科学家已经知道某些疾病与特定的基因或遗传突变有关。然而，遗传原 因仅能解释人类中诊断的一部分疾病。许多疾病似乎在某种程度上与免疫系统对传染原和 环境因素的应答有联系，但免疫系统如何在疾病诸如癌症、阿尔兹海默病、肋软骨炎、纤维 肌痛、狼疮和其他疾病中发挥作用仍然需要确定。人类基因组包含总数为567-588个的Ig (免疫球蛋白)和TR(T细胞受体)基因 (339-354个Ig基因和2观-234个TR基因)/单倍体基因组，它们位于7个主要基因座中。 它们包括405-418个V、32个D、105-109个J和25-29个C基因。功能性Ig和TR基因的数 目为每个单倍体基因组321-353个。它们包括187-216个V、28个D、86_88个J和20-21个 C基因(http://imgt.cines.fr)。通过这些基因的重排，已经估计可以产生大概2. 5 X IO7 种可能的抗体或T细胞受体。尽管在种系水平，人类能够产生大量不同的Ig和TR，但对于特定个体，由于B细胞 和τ细胞发育期间的阴性选择，可用的Ig和TR的数目实际上少得多。在一些个体中，此过 程可能不能去除一些将与机体的自身组织交叉反应的细胞，并且这可能是一些类型的自身 免疫性疾病的原因。迄今少数疾病与机体对共同抗原的反应(I^rinz，J.等，Eur. Τ. Immunol.(欧 洲免疫学杂志)(1999)29(10) :3360-3368, “ Selection of Conserved TCR VDJ Rearrangements in Chronic Psoriatic Plaques Indicates a Common Antigen in Psoriasis Vulgaris (在慢性银屑病斑块中保守的TCR VDJ重排的选择指示寻常性银屑病 中的共同抗原)〃)和/或对特定的VDJ重排(Tamaru，J.等,Blood(血液)(1994)84(3) 708-715, “ Hodgkin ‘ s Disease with a B-cell Phenotype Often Shows a VDJ Rearrangement and Somatic Mutations in the Vh Genes (Mc^ B Ifi^M ^β^^^ΙΙ 常显示VDJ重排和VH基因中的体细胞突变)“)相关。所需要的是用于评价人免疫应答的 变化和将这些变化与特定疾病相关的更好方法。专利技术概述本专利技术涉及一种产生人和/或动物的免疫状态谱(immune status profile, ISP) 的方法。在本专利技术的一个方面，该方法包括以下的步骤使用靶特异性引物在第一次扩增反 应中扩增来自至少一个人或动物受试者的白细胞样品中的至少一种RNA和/或DNA从而产 生至少一种扩增子，所述靶特异性引物的至少一部分包含另外的核苷酸从而将共用引物的结合位点引入至所得的扩增子中；从所述第一次扩增反应中拯救所述至少一种扩增子；通 过在第二次扩增反应中加入共用引物，扩增具有共用引物的至少一个结合位点的所述第一 次扩增反应的扩增子；以及将所述所述第二次扩增反应的扩增子测序以鉴定和量化表现抗 体和/或受体重排的DNA序列，从而建立免疫状态谱。在本专利技术的另一个方面，从所述第一次扩增反应中拯救所述至少一种扩增子的步 骤可以省略，并且第一次和第二次扩增反应可以在不将扩增子与靶特异性引物分开的条件 下进行。基因组DNA也可以扩增，并且扩增DNA的步骤可以替代扩增RNA的步骤，尤其是在 需要分析免疫系统组分诸如主要组织相容性复合物(MHC)的情况下。在本专利技术的多个方面中，自细胞亚群可以通过流式细胞术分离，从而将幼稚B细 胞、成熟B细胞、记忆B细胞、幼稚T细胞、成熟T细胞和记忆T细胞分开。在该方法的多个 方面中，细胞亚群的重组是B细胞免疫球蛋白重链(IgH)，κ和/或λ轻链(IgK，IgL)，T 细胞受体β、Y、S和/或主要组织相容性复合物(MHC)分子I或II的重排。在本专利技术的另一个方面中，该方法还可以包括将正常个体的群体的免疫细胞谱与 已经诊断有疾病的个体的群体的免疫细胞谱进行汇编和比较，以确定特定的重排或重排组 和所述疾病之间是否存在相关性。在本专利技术的另一个方面中，该方法可以包括将对已经施用了疫苗的个体的群体鉴 定的免疫细胞谱与没有施用疫苗的个体的群体的免疫细胞谱进行比较以评价所述疫苗在 产生免疫应答中的功效。附图简要说明图Ia和图Ib是图示说明通过本专利技术的方法使用本文公开的引物获得的扩增产物 的存在的凝胶的照片。图2说明用于(a)健康对照样品中的Ig重链，(b)来自结肠癌患者的血样中的 TCR^链，(c)来自慢性淋巴细胞性白血病患者(CLL)的血样中的IgK链，和(d)来自系统 性红斑狼疮患者(SLE)的血样中的IgX链的结构域的分布。空的斑点表示缺少与相应的 V-J组合相关的序列，并且柱的高度表示特定序列出现的频率。碰本专利技术人已经开发了一种用于评价来自大量细胞的抗体和受体重排的方法，该方 法用于比较在个体的群体中鉴定的重排，以确定特定的重排或重排组和疾病，或疾病的某 些症状之间是否存在相关性。该方法还用于建立一个或多个个体响应于传染原和/或环境 因素的免疫应答史，以及用于评价疫苗的功效。本专利技术涉及一种用于产生人和/或动物的免疫状态谱(ISP)的方法。在本专利技术的 一个方面中，该方法包括以下的步骤使用靶特异性引物在第一次扩增反应中扩增来自至 少一个人或动物受试者的白细胞样品中的至少一种RNA，从而产生至少一种扩增子，所述靶 特异性引物的至少一部分包含另外的核苷酸以将共用引物的结合位点引入至所得的扩增 子中；从所述第一次扩增反应中拯救所述至少一种扩增子；通过在第二次扩增反应中加入 共用引物，扩增具有共用引物的至少一个结合位点的所述第一次扩增反应的扩增子；以及 将所述第二次扩增反应的扩增子测序以鉴定和量化表现抗体和/或受体重排的DNA序列， 从而建立免疫状态谱。在本文使用术语“包含”时，还可以使用“基本上由……组成”和“由……组成”。术语“免疫状态谱”意指个体或个体的群体的谱，该谱指示存在和/或不存在代表特定的重排 的序列以及它们出现的频率，所述特定的重排代表人和/或动物免疫系统的B细胞、T细胞 和/或其他细胞的多样性。在本文中提到扩增子“被拯救”时，要理解的是扩增子拯救可以 通过将扩增子与用来形成它们的引物分离而发生，或可以通过如下而发生，即，稀释扩增子 /引物混合物从而，由于来自第一次扩增反应的扩增子显著多于引物的事实，使得那些引物 的作用在使用不同引物的第二次扩增反应中被最小化。“共用引物”是可以用来扩增通常具 有非全同序列但因为它们含有相同引物的结合位点而享有序列相似性的多核苷酸(例如， 通过靶特异性引物产生的来自第一次扩增的扩增子)的那些引物。共用引物通常针对其在 引导成功的扩增时的效率来选择，因此它们的应用有效地在本专利技术的方法中以非靶特异性 的方式实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生人和／或动物的免疫状态谱的方法，该方法包括：　　（ａ）使用靶特异性引物，在第一次扩增中，扩增来自人或动物受试者的白细胞样品中的至少一种ＤＮＡ和／或ＲＮＡ从而产生至少一种第一扩增子，所述靶特异性引物的至少一部分包含另外的核苷酸，从而将共用引物的结合位点引入至所述至少一种第一扩增子中；　　（ｂ）从所述第一次扩增中拯救所述至少一种第一扩增子；　　（ｃ）使用至少一个共用引物，在第二次扩增中，扩增所述至少一种第一扩增子以产生至少一种第二扩增子；以及　　（ｄ）将所述至少一种第二扩增子测序以鉴定和量化表现重排的一个或多个ＤＮＡ序列，从而建立免疫状态谱。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/045,5862008年4月16日1.一种产生人和/或动物的免疫状态谱的方法，该方法包括(a)使用靶特异性引物，在第一次扩增中，扩增来自人或动物受试者的白细胞样品中的 至少一种DNA和/或RNA从而产生至少一种第一扩增子，所述靶特异性引物的至少一部分 包含另外的核苷酸，从而将共用引物的结合位点引入至所述至少一种第一扩增子中；(b)从所述第一次扩增中拯救所述至少一种第一扩增子；(c)使用至少一个共用引物，在第二次扩增中，扩增所述至少一种第一扩增子以产生至 少一种第二扩增子；以及(d)将所述至少一种第二扩增子测序以鉴定和量化表现重排的一个或多个DNA序列， 从而建立免疫状态谱。2.权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤(e)将所述一个或多个DNA序列输 入至数据库中以提供可以存储在计算机、服务器或其他电子存储设备上的数据，(f)将鉴定 与所述序列对应的个体的信息和特征的数据集作为可以存储在计算机、服务器或其他电子 存储设备上的数据输入，以及(g)对于一个或多个个体评价步骤(e)和步骤(f)的数据，以 确定在所述一个或多个序列和与所述一个或多个序列对应的所述个体的一个或多个特征 之间是否存在相关性。3.权利要求1所述的方法，其中所述靶特异性引物选自下列各项组成的组SEQID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO :8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:.13、SEQ IDNO:14,SEQ IDNO:15,SEQ IDNO:16,SEQ IDNO:17,SEQ IDNO:18,SEQ IDNO 19、SEQIDNO 20,SEQIDNO :31、SEQIDNO 32、SEQIDNO 33, SEQIDNO 34、SEQIDNO :35,SEQIDNO :36,SEQIDNO :37,SEQIDNO :38,SEQIDNO :39,SEQIDNO :40,SEQID NO:41,SEQID NO:42,SEQID NO :43,SEQID NO 44、SEQID NO 45、SEQID NO .46、SEQ IDNO:47,SEQ IDNO:48,SEQ IDNO:49,SEQ IDNO:50,SEQ IDNO:51,SEQ IDNO 52、SEQIDNO 53,SEQIDNO 54, SEQIDNO 55、SEQIDNO :56, SEQIDNO 57、SEQIDNO :58,SEQIDNO :59,SEQIDNO :60,SEQIDNO :61,SEQIDNO :62,SEQIDNO :63,SEQID NO:64,SEQID NO:65,SEQID NO :66,SEQID NO 67、SEQID NO 68、SEQID NO .69、SEQ IDNO:70,SEQ IDNO:71,SEQ IDNO:72,SEQ IDNO:73,SEQ IDNO:74,SEQ IDNO :75,SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87,SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO =IOUSEQ ID NO : 102、 SEQ ID NO :103,SEQ ID NO :104,SEQ ID NO :105,SEQ ID NO :106,SEQ ID NO :107,SEQ ID NO :108, SEQ ID NO :109, SEQ ID NO :110、SEQ ID NO : 111、SEQ ID NO :112、SEQ ID NO 113、SEQ I DNO :114, SEQ ID NO :115, SEQ ID NO :116, SEQ ID NO :117, SEQ ID NO :118, SEQ ID NO 119,SEQ ID NO :120,SEQ ID NO :121、SEQ ID NO :122,SEQ ID NO : 123、SEQ ID NO :124, SEQ ID NO :125, SEQ ID NO :126, SEQ ID NO :127, SEQ ID NO :128, SEQ ID NO 129、SEQ ID NO :130, SEQ ID NO :131, SEQ ID NO :132, SEQ ID NO :133, SEQ ID NO :134, SEQ ID NO :135,SEQ ID NO : 136、SEQ ID NO :137,SEQ ID NO : 138、SEQ ID NO :139,SEQ ID NO :140, SEQ ID NO :151, SEQ ID NO :152, SEQ ID NO :153, SEQ ID NO :154, SEQ ID NO 155、SEQ ID NO :156, SEQ ID NO :157, SEQ ID NO :158, SEQ ID NO :159, SEQ ID NO :160,SEQ ID NO :161, SEQ ID NO :162、SEQ ID NO :163、SEQ ID NO :164、SEQ ID NO :165、SEQ ID NO :166,SEQ ID NO 167,SEQ ID NO 168,SEQ ID NO 169,SEQ ID NO 170,SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO :172、SEQ ID NO :173、SEQ ID NO :174、SEQ ID NO :175、SEQ ID NO :176、 SEQ ID NO :177,SEQ ID NO 178,SEQ ID NO 179,SEQ ID NO 180,SEQ ID NO 181,SEQ ID NO :182, SEQ ID NO :183、SEQ ID NO :184、SEQ ID NO :185、SEQ ID NO :186、SEQ ID NO 187、SEQ ID NO :188、SEQ ID NO :189、SEQ ID NO :190、SEQ ID NO :191、SEQ ID NO :192、 SEQ ID NO :193,SEQ ID NO 194、SEQ ID NO 195,SEQ ID NO :196、SEQ ID NO 197,SEQ ID NO :198, SEQ ID NO :199、SEQ ID NO :200、SEQ ID NO :201、SEQ ID NO :202、SEQ ID NO 203、SEQ ID NO :204、SEQ ID NO :205、SEQ ID NO :206、SEQ ID NO :207、SEQ ID NO :208、 SEQ ID NO :209,SEQ ID NO :210、SEQ ID NO :211、SEQ ID NO :212、SEQ ID NO :213,SEQ ID NO :214, SEQ ID NO :215, SEQ ID NO :216, SEQ ID NO :217, SEQ ID NO :218, SEQ ID NO 219、SEQ ID NO :220, SEQ ID NO :221, SEQ ID NO :222, SEQ ID NO :223, SEQ ID NO :224, SEQ ID NO :225,SEQ ID NO :226,SEQ ID NO :227,SEQ ID NO :228,SEQ ID NO :229,SEQ ID NO :230, SEQ ID NO :231、SEQ ID NO :232, SEQ ID NO :233, SEQ ID NO :234, SEQ ID NO 235、SEQ ID NO :236, SEQ ID NO :237, SEQ ID NO :238, SEQ ID NO :239, SEQ ID NO :240, SEQ ID NO :241,SEQ ID NO :242,SEQ ID NO :243,SEQ ID NO :244,SEQ ID NO :245、SEQ ID NO :246, SEQ ID NO :247, SEQ ID NO :248, SEQ ID NO :249, SEQ ID NO :250, SEQ ID NO 251、SEQ ID NO :252, SEQ ID NO :253, SEQ ID NO :254, SEQ ID NO :255, SEQ ID NO :256, SEQ ID NO :257,SEQ ID NO :258,SEQ ID NO :259,SEQ ID NO :260,SEQ ID NO :261,SEQ ID NO :262, SEQ ID NO :263, SEQ ID NO :264, SEQ ID NO :265, SEQ ID NO :266, SEQ ID NO 267、SEQ ID NO :268, SEQ ID NO :269, SEQ ID NO :270, SEQ ID NO :271, SEQ ID NO :272, SEQ ID NO :273,SEQ ID NO :274、SEQ ID NO :275、SEQ ID NO :276、SEQ ID NO :277、SEQ ID NO :278, SEQ ID NO :279, SEQ ID NO :280, SEQ ID NO :281、SEQ ID NO :282, SEQ ID NO 283、SEQ ID NO :284, SEQ ID NO :285, SEQ ID NO :286, SEQ ID NO :287, SEQ ID NO :288, SEQ ID NO :289,SEQ ID NO :290,SEQ ID NO :291,SEQ ID NO :292,SEQ ID NO :293,SEQ ID NO :294, SEQ ID NO :295, SEQ ID NO :296, SEQ ID NO :297, SEQ ID NO :298, SEQ ID NO 299、SEQ ID NO :300, SEQ ID NO :301、SEQ ID NO :302, SEQ ID NO :303, SEQ ID NO :304,...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩建，
申请(专利权)人：哈森阿尔法生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：US