描述了通常不能利用半乳糖作为碳源但根据本文的方法已被基因工程化为利用半乳糖作为单一碳源的低等真核细胞例如巴斯德毕赤酵母。细胞被基因工程化为表达包含Ｌｅｌｏｉｒ途径的酶中的几种。具体地，细胞被基因工程化为表达半乳糖激酶、ＵＤＰ－半乳糖－Ｃ４－差向异构酶和半乳糖－１－磷酸尿苷酰转移酶，以及任选地半乳糖通透酶。另外，提供了用于改进在已被基因工程化为产生具有Ｎ－聚糖（其具有半乳糖残基）的糖蛋白但通常缺乏包含Ｌｅｌｏｉｒ途径的酶的细胞中具有半乳糖末端的或含有半乳糖的Ｎ－聚糖的产量的方法，所述方法包括用编码半乳糖激酶、ＵＤＰ－半乳糖－Ｃ４－差向异构酶和半乳糖－１－磷酸尿苷酰转移酶的一种或多种核酸分子转化细胞。描述的方法和宿主细胞使得同化半乳糖的能力的存在或缺乏作为用于制备重组细胞的选择方法。所述方法和宿主细胞在本文显示对于制备具有半乳糖末端的或含有半乳糖的Ｎ－聚糖的免疫球蛋白和类似物是特别有用的。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在糖工程化的酵母巴斯德毕赤酵母中对半乳糖同化途径的代谢工程化
技术介绍
(1)专利
本专利技术涉及低等真核细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，其通常不能利用半乳糖作为碳源，但通过基因工程化细胞为表达包含Leloir途径的酶中的几种，使其能够利用半乳糖作为单一碳源。具体地，细胞被基因工程化为表达半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，以及任选地半乳糖通透酶。另外，本专利技术进一步涉及用于改进在已被基因工程化为产生具有N-聚糖(其具有半乳糖残基)的糖蛋白但通常缺乏包含Leloir途径的酶的低等真核细胞中具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的产量的方法，包含用编码半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-ι-磷酸尿苷酰转移酶的一个或多个核酸分子转化低等真核细胞。(2)相关领域的描述基于蛋白的疗法组成了药物发现的最活跃领域之一并被期望是未来十年新的治疗用化合物的主要来源(Walsh，Nat. Biotechnol. 18(8) :831-3 (2000)) 0治疗用蛋白 (在它们的天然状态未被糖基化)可在缺乏糖基化机制的宿主中表达，例如埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)。但是，大多数治疗用蛋白是糖蛋白，其需要在蛋白的特定天冬酰胺残基翻译后添加聚糖，以确保正确的折叠和随后在人血清中的稳定性(Helenius 和Aebi，Science 291 :2364-9 (2001)) 0在一些情况中，治疗用蛋白的效力已通过在另外的糖基化位点中的工程化而被改进。一个实例是人红细胞生成素，其添加另外两个糖基化位点后已表明在体内显示三倍长的半衰期(Macdougall等人，J.Am. Soc. Nephrol. 10 2392-2395(1999))。意在人中用于治疗用途的大多数糖蛋白需要N-糖基化，因此，哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其具有类似的人糖蛋白加工，目前最常用于生产治疗用糖蛋白。但是，这些细胞系具有明显的缺点，包括较差的基因溯源性、较长的发酵时间、异源糖基化和正在发生的病毒污染问题(Birch和Racher, Adv.药物Deliv. Rev. 58 671-85(2006) ；Kalyanpur, Mol.Biotechnol. 22 :87-98(2002))。许多工业蛋白表达系统基于可在化学上成分确定的培养基中生长至高细胞密度且通常不受上述限制的酵母菌株(Cereghino和Cregg FEMS Microbiol. Rev. 24 45-66(2000) ；Hollenberg 禾口 Gellisen， Curr. Opin. Biotechnol. 8 :554-560(1997)； Muller，酵母14 U67-1283 (1998)。尽管酵母已被用于生产缺乏糖基化的治疗用蛋白，例如胰岛素，但是其仍未被用于糖蛋白生产，因为酵母产生具有非人的、高甘露糖型N-聚糖的糖蛋白(参见图1)，其产生具有缩短的体内半衰期并在高等哺乳动物中具有免疫原潜能的糖蛋白(Tanner 等人，Biochim. Biophys. Acta. 906 :81-99 (1987))。为解决这些问题，本专利技术人和其他研究者已聚焦到各种不同酵母和丝状真菌中糖基化途径的再工程化，以从这些蛋白表达宿主中获得人样糖蛋白。例如，Gerngr0ss等人， 美国公开的申请号2004/0018590 (所述公开内容在此通过参考并入本文)提供酵母巴斯德毕赤酵母的细胞，其已被基因工程化为消除酵母和丝状真菌典型的高甘露糖-型N-聚糖的产生和提供具有糖基化机制的宿主细胞以产生具有杂合或复合N-聚糖的糖蛋白，即哺乳动物细胞产生的更典型的糖蛋白。Gerngross等人如上公开了重组酵母菌株，该重组酵母菌株可生产其上高百分比的N-聚糖含有半乳糖残基的重组糖蛋白S卩，产生主要具有寡糖结构 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Gl)或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G2)和较少量寡糖结构 GlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO)的N-聚糖的酵母菌株。已获得70-85%的G2产率。但是，已发现在这些细胞中生产的一些糖蛋白例如免疫球蛋白和免疫粘附素，其中GO G1/G2的比值降低至约2 1(参见例如，Li等人，Nature Biotechnol. 24 :210-215 Q006)，其中通过用半乳糖和可溶型β -1，4-半乳糖基转移酶体外处理糖蛋白，这些细胞中半乳糖末端的N-聚糖的产率得到改进)。相反，哺乳动物细胞例如CHO细胞中生产的免疫球蛋白的GO G1/G2 的比值约1 1。因此，期望的是提供能够在体内产生GO G1/G2比值小于2 1的重组糖蛋白的重组酵母宿主细胞。巴斯德毕赤酵母仅可利用有限数量的碳源以生存。目前，这些碳源是甘油、葡萄糖、甲醇以及可能是鼠李糖和甘露糖，但不是半乳糖。期望的是具有可利用上述所列以外的碳源的巴斯德毕赤酵母菌株。专利技术概述本专利技术解决了上述确定的问题。本专利技术提供方法和材料用于从缺乏同化半乳糖作为碳源的能力的宿主细胞产生具有利用半乳糖作为能源的能力的重组宿主细胞。当重组宿主细胞被进一步基因工程化为生产具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白时，该宿主细胞能够产生重组糖蛋白例如抗体，其中GO G1/G2比值小于2 1、或 GO G1/G2比值为1 1或更小或GO G1/G2比值为1 2或更小。一般而言，所述包括将编码Leloir途径酶(半乳糖激酶、UDP-半乳糖-C4-差向异构酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶以及任选地半乳糖通透酶)引入宿主细胞核酸分子。因此，本文中的方法和材料提供选择系统，其仅通过在含有半乳糖作为碳源的培养基上培养细胞可用于鉴定已被转化宿主细胞，以及提供用于生产糖蛋白(具有高水平的末端的或含有半乳糖的N-聚糖)例如免疫球蛋白的方法。利用半乳糖作为碳源的能力提供了选择使用的表达系统的灵活性和经济性。例如，在设计用于表达具有末端半乳糖或末端唾液酸化的重组糖蛋白的系统中，可将半乳糖添加至培养基，半乳糖被细胞吸收和被细胞利用作为能源并提供半乳糖残基用于参入 N-聚糖，其在重组糖蛋白上被合成。本专利技术的优势是通过使半乳糖存在于培养基或在发酵过程中添加半乳糖和/或诱导重组糖蛋白，重组蛋白的生产可得到高水平的半乳糖基化的或唾液酸化的糖蛋白。因此，如巴斯德毕赤酵母所表明的，通常缺乏Leloir途径的酵母物种，以本文公开的方式基因工程化巴斯德毕赤酵母产生可利用半乳糖作为单一碳源的重组巴斯德毕赤酵母细胞系。另外，基因工程化巴斯德毕赤酵母细胞系(包括Leloir途径酶和使得细胞能够产生具有半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的糖蛋白所需的酶)产生了这样的重组细胞系，其中半乳糖末端的或含有半乳糖的N-聚糖的产率大于缺乏Leloir途径酶的细胞系。因此，本专利技术引起了已被基因工程化为生产半乳糖基化的或唾液酸化的糖蛋白的巴斯德毕赤酵母细胞系的增加的生产率。具体地，本专利技术提供了用于在体内生产具有高水平半乳糖或唾液酸的抗体的方法6和材料。利用本专利技术的方法和材料，将半乳糖添加至细胞生长培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种巴斯德毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主细胞，其已被基因工程化为表达半乳糖激酶活性、ＵＤＰ－半乳糖－４－差向异构酶活性、半乳糖－１－磷酸尿苷酰转移酶活性以及任选地半乳糖通透酶活性，其中所述宿主细胞能够利用半乳糖作为单一碳能源。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·C·戴维森，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：US
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