固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及制药和生物技术领域，利用包含亮氨酸脱氢酶及能使辅因子再生的甲酸脱氢酶的全细胞催化剂还原α-酮酸制备非天然氨基酸；尤其是以三甲基丙酮酸为底物酶法合成L-叔亮氨酸，将亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶克隆到重组大肠杆菌中共表达，并将细胞固定化；利用固定化全细胞催化，不用加入“外来”辅因子而对底物进行转化。且固定化全细胞催化具有成本低，操作方便的优点，本方法属于生物合成法，反应条件温和，作用专一，无副产物，在医药及食品等行业中均有应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于制药工业生物
，涉及一种。
技术介绍
非天然氨基酸结构和功能多样，是很多药物合成中常用的中间体，例如L-叔亮氨酸。α -酮酸(化合物式1)通过生物催化可生成非天然氨基酸(化合物2和化合物 3) ο权利要求1.，其特征在于，包括以下步骤(1)将固定化全细胞催化剂、α-酮酸盐、甲酸铵及磷酸缓冲液混合，在PH6.0 9.0、 25 40°C条件下反应5 20小时；反应混合液中固定化全细胞催化剂湿重浓度为10 200g/L, α -酮酸盐浓度为100 1000mmol/L,甲酸铵浓度为500 1500mmol/L ；所述的固定化全细胞催化剂中含有重组细胞，重组细胞中含有甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因；(2)回收固定化全细胞催化剂，反应液降温至5 15°C，ph调节至13 14;5 15°C 下，滴加氯甲酸甲酯，搅拌反应8 16小时；ph调节至1.5 3，5 15°C下，萃取洗涤干O2.权利要求1所述，其特征在于，步骤 (1)中还加入NAD+，浓度为0. 05 0. 5g/L。3.权利要求1所述，其特征在于，所述固定化全细胞催化剂的制备方法为(1)将含有亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的重组质粒转入大肠杆菌宿主菌，得到重组细胞；(2)将重组细胞与固定剂溶液混合，铺于平面上，25 35°C下保温1 1.5小时，并用盐溶液稳定后洗涤；固定剂为聚乙二醇与聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙中至少一种的混合物；聚乙二醇的浓度为0. 08 0. lg/ml ；聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙浓度为0. 1 0.2g/ml。4.权利要求1所述，其特征在于，所述 α-酮酸盐结构如式1所示，R为脂肪侧链、苯基或苄基。5.权利要求1或4所述合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，步骤(1)中的α-酮酸盐为三甲基丙酮酸钠盐。6.权利要求1所述，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因序列和甲酸脱氢酶基因序列分别如SEQ ID No. 1及SEQ ID No. 2所示。7.权利要求1或6所述，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因选自球形芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌；甲酸脱氢酶基因选自路德酵母或博伊丁假丝酵母。全文摘要本专利技术涉及制药和生物
，利用包含亮氨酸脱氢酶及能使辅因子再生的甲酸脱氢酶的全细胞催化剂还原α-酮酸制备非天然氨基酸；尤其是以三甲基丙酮酸为底物酶法合成L-叔亮氨酸，将亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶克隆到重组大肠杆菌中共表达，并将细胞固定化；利用固定化全细胞催化，不用加入“外来”辅因子而对底物进行转化。且固定化全细胞催化具有成本低，操作方便的优点，本方法属于生物合成法，反应条件温和，作用专一，无副产物，在医药及食品等行业中均有应用价值。文档编号C12P13/04GK102352387SQ201110277030公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日专利技术者孙勇, 张淑蓉, 文军, 曾聪明, 梁晓亮, 王波, 王玉全 申请人:尚科生物医药(上海)有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）将固定化全细胞催化剂、α－酮酸盐、甲酸铵及磷酸缓冲液混合，在ｐＨ６．０～９．０、２５～４０℃条件下反应５～２０小时；反应混合液中固定化全细胞催化剂湿重浓度为１０～２００ｇ／Ｌ，α－酮酸盐浓度为１００～１０００ｍｍｏｌ／Ｌ，甲酸铵浓度为５００～１５００ｍｍｏｌ／Ｌ；所述的固定化全细胞催化剂中含有重组细胞，重组细胞中含有甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因；（２）回收固定化全细胞催化剂，反应液降温至５～１５℃，ｐｈ调节至１３～１４；５～１５℃下，滴加氯甲酸甲酯，搅拌反应８～１６小时；ｐｈ调节至１．５～３，５～１５℃下，萃取洗涤干燥。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王波，梁晓亮，王玉全，曾聪明，孙勇，张淑蓉，文军，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31