本发明专利技术公开了一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用，涉及生物技术领域中的创新药物。本药物由蛋白转导标签、双链RNA检测结构域和细胞凋亡诱导结构域组成。本制备方法包括基因重组蛋白的构建、表达和纯化。本应用包括细胞模型实验、动物模型实验和对在感染细胞期间产生dsRNA的DNA或RNA病毒起抗病毒作用。本发明专利技术依据纯细胞抗病毒天然机制设计，可靠性高；广谱抗病毒，特异性高；无毒副作用，安全性高；实验结果重复性好，易于推广；研制生产简便，成本低廉。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中的创新药物，尤其涉及一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用。
技术介绍
现今，引起人类病毒性疾病的病毒病原体越来越受关注，其中包括自然界新发突发病毒如禽流感病毒、SARS (冠状病毒)等，临床方面的病毒如肝炎病毒、HIV (艾滋病毒) 等，以及相关潜在的造成生物恐慌的病毒如天花、埃博拉病毒等。遗憾的是，对于上述病毒， 至今缺乏非常有效的预防性和治疗性措施，现主要的措施可以分为三大类1、干扰素和抗炎症因子虽然对部分病毒有效，但对其它类病毒缺乏特异性，由于自身是细胞类因子，如过量摄入，其与免疫系统等因子相互作用，会导致宿主细胞类因子水平失衡，产生较大副作用。2、特异性抑制因子对病毒复制转录等过程中所必需靶点起抑制作用的特异性抑制因子(如HIV蛋白酶抑制因子)，但其缺点是病毒发生突变，改变相应靶点时，能致使其有效的逃脱抑制因子的抑制作用，所以抑制因子不能迅速有效地应对新发突发的病毒病原体，药物使用后产生的副作用无法进行预测。3、疫苗由于针对不同病毒研制特异性疫苗的周期较长，对于新发突发病毒病原体的预防和治疗不是及时有效的，并且疫苗的研制困难也相当巨大，这主要体现在一、病毒种类繁多；二、同一种病毒其各种亚型复杂，例如疫苗只能特异性的针对一种病毒，对其他型别的病毒无交叉保护反应，宿主得不到很好的保护。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有技术存在的上述缺点和不足，提供一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用。本专利技术的目的是这样实现的技术思路设计一组基因重组蛋白质，其能特异性、快速、有效地引起受病毒感染细胞的凋亡，而不损害未受感染的宿主细胞。基因重组蛋白预防治疗与两个细胞天然机制相关联1、干扰素途径中的dsRNA (双链RNA)检测大部分病毒的基因组为双链RNA或单链RNA。病毒感染细胞在复制和转录期间产生dsRNA ；其余病毒基因组为DNA的病毒通过对称性转录同样能产生典型的dsRNA，相反未受感染的细胞通常不会产生，宿主细胞天然防御机制通过上述细胞是否产生dsRNA来进行检测、捕获和消灭受病毒感染的细胞。干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶由N末端包含的两个结构域dsRBMl和dsRBM2 (dsRNA结合基序1和2)和C末端的激酶结构域所组成，干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶与dsRNA相结合后，通过反向自磷酸化从而激活蛋白激酶，活化的蛋白激酶再磷酸化eIF_2a(转录因子)，因此能抑制病毒蛋白的翻译过程。2、细胞凋亡途径凋亡复合体包含胞内凋亡信号分子，比如凋亡蛋白酶活化因子1，FLICE(死亡受体)激活死亡结构域等。前体凋亡蛋白酶通过剪切活化进而激活下游的凋亡蛋白酶和一系列的细胞内蛋白质，从而杀死细胞。由于干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶激活进程和凋亡蛋白酶激活进程具有相似的途径以及各蛋白中各结构域都有良好的功能，所以上述的两条途径可以结合形成一条广谱抗病毒的新型途径。本基因重组蛋白质，其结构域包含dsRNA结合区、凋亡诱导区(凋亡蛋白酶原结合区)，如细胞内存在dsRNA，其将会检测到dsRNA并与之结合，进而诱导细胞的凋亡，相反如dsRNA不存在于细胞中，反应则不会发生。为了使其能在体内或体外细胞传递，在基因重组蛋白序列中加入转导标签序列，比如转录反式激活蛋白、蛋白转导结构域域-4、多聚精氨酸。这些转运标签蛋白能转运体内或者体外所有细胞类型中的蛋白分子，甚至能穿透血脑屏障。具体地说1、广谱抗病毒的药物广谱抗病毒的药物由蛋白转导标签、双链RNA检测结构域和细胞凋亡诱导结构域组成①蛋白转导标签蛋白转导标签为下列A、B或CA -M^iE^W^i^:^ (Trans-activator Transcription),氨基酸序列如SEQ NO. 1所示；B 蛋白转导结构域 4(Protein Transduction Domain 4)，氨基酸序列如SEQ N0. 2所示；C 多聚精氨酸(Polyarginine)，氨基酸序列如SEQ NO. 1所示。②双链RNA检测结构域双链RNA检测结构域为下列A、B或CA 干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶(Interferon-inducible RNA-dependent protein kinase),氨基酸序列如SEQ Ν0. 4所示；B :2-5A 依赖的核糖核酸酶(2-5A_d印endent ribonuclease)，氨基酸序列如SEQ N0. 5所示；C 牛痘病毒E3L蛋白(E3L)，氨基酸序列如SEQ N0. 6所示。③细胞凋亡诱导结构域细胞凋亡诱导结构域为下列A、B或CA 生长抑制基因 3 蛋白(Growth-inhibiting gene 3protein)，氨基酸序列如SEQ N0. 7所示；B ^JltS S BIiS^ "I (Apoptotic protease activating factor—I)，氨基酸序列如SEQ NO. 8所示；C 鼠凋亡蛋白酶活化因子-1(murine Apoptotic protease activating factor-1),氨基酸序列如SEQ NO. 9所示。2、本广谱抗病毒药物的制备方法本广谱抗病毒药物的制备方法包括基因重组蛋白的构建、表达和纯化a、收集培养的细胞，利用Trizol法(来源于中国大连宝生物公司)提取细胞总RNA ；b、对提取的细胞总RNA，利用针对上述基因重组蛋白各区域设计的特异性引物 (注附带酶切位点)，进行一步PCR扩增，即先利用随机引物进行反转录，将RNA反转录成 cDNA，再利用特异性引物扩增得到相应的基因重组蛋白各区域序列；C、切胶回收目的片段，连接T载体测序验证所扩增序列正确性；d、分别对目的片段和pET32a(原核生物表达载体)进行双酶切和连接，构建基因重组蛋白克隆；e、将构建好的克隆转化大肠杆菌(BL21)，IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导目的蛋白的表达(注转导标签位于N/C端或NC两端)；f、根据表达蛋白质His-Tag(组氨酸标签)，将重组蛋白过滤His融合蛋白纯化柱， 得到纯化的基因重组蛋白质。3、本广谱抗病毒药物的应用①细胞模型实验a、取培养好的细胞，如Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)，分A、B两组并作好标记；b、A组作对照组，B组接种病毒，如肠道病毒等；c、在A组细胞中(如7瓶)，同时分别对应加入(如7种)ddH20(双蒸水作对照组)、基因重组蛋白、基因重组蛋白突变体(dsRNA检测结构域干扰素诱导的RNA依赖的蛋白激酶氨基酸序列F10E)、大肠杆菌提取物、基因重组蛋白各组分(缺失蛋白转导标签的基因重组蛋白A、缺失dsRNA检测结构域的基因重组蛋白B以及缺失细胞凋亡诱导结构域的基因重组蛋白质C)并作标记；d、在B组接种病毒细胞中，分别加入c步骤中的各成分并作标记；e、A、B组细胞添加上述各种成分后，置于CO2培养箱培养3 5天时间；f、3 5天后，将A、B组细胞置于显微镜下观察记录各组细胞的存活率；g、结果判断A组细胞中，即未接种病毒的细胞，对照组细胞生长正常，细胞存活率高，与对照组细胞相比，其余细胞，细胞存活率相近，接近100%，说明加入的其余六种物质，即基因重组蛋白、基因重组蛋白突变体、大肠杆菌提取物、基因重组蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种广谱抗病毒的药物，其特征在于：广谱抗病毒的药物由蛋白转导标签、双链ＲＮＡ检测结构域和细胞凋亡诱导结构域组成：①蛋白转导标签为下列Ａ、Ｂ或ＣＡ：转录反式激活蛋白，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．１所示；Ｂ：蛋白转导结构域４，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．２所示；Ｃ：多聚精氨酸，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．３所示；②双链ＲＮＡ检测结构域为下列Ａ、Ｂ或ＣＡ：干扰素诱导的ＲＮＡ依赖的蛋白激酶，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．４所示；Ｂ：２－５Ａ依赖的核糖核酸酶，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．５所示；Ｃ：牛痘病毒Ｅ３Ｌ蛋白，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．６所示；③细胞凋亡诱导结构域为下列Ａ、Ｂ或ＣＡ：生长抑制基因３蛋白，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．７所示；Ｂ：凋亡蛋白酶活化因子－１，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．８所示；Ｃ：鼠凋亡蛋白酶活化因子－１，氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．９所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：项荣，石迎迎，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83
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