本发明专利技术公开了短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因faldh及其植物表达载体的构建方法和应用，提供了能提高甲醛耐受能力的短芽孢杆菌faldh基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质的氨基酸序列，用该基因构建植物表达载体pK2GW7-35S-faldh，并通过农杆菌介导转入植物中，使植物提高对甲醛的吸收、代谢和耐受能力，克服植物本身甲醛代谢关键酶表达水平较低，吸收代谢甲醛能力低的缺点；实验证明含有甲醛脱氢酶faldh基因的转基因植物吸收液体中甲醛的速率优于野生型；通过转基因植物表达的FALDH蛋白有氧化甲醛的能力，且稳定性好，能一直在植物中发挥作用；FALDH蛋白在转基因植物中的过量表达使其代谢气体甲醛的能力大大提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因及其甲醛脱氢酶基因植物表达载体V^aidh及该基因在提高植物吸收和耐受甲醛能力强的转基因植物中的应用。
技术介绍
甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚。它反应能力极强， 能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应(Feldman等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1973，13:1-49)，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物来说都有很高的毒性。 甲醛被广泛用于工业生产中，是制造树脂、胶粘剂、油漆、塑料、人造纤维的原料，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高，各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染公认最具代表性的化学物质。人们入住新居都要进行室内装饰和更新家具，其正是室内空气甲醛污染的主要来源。甲醛污染危害严重的场所是居室、办公室、会议室、宾馆、KTV包房、家具商场、建材商场等。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08 (mg /立方米)，有调查表明新的宾馆客房室内空气中甲醛浓度最高达0. 36mg/立方米，平均为0. 173mg/立方米， 是室外对照的13倍。而家具商场最高达0. 873mg/立方米，平均为0. 432mg/立方米，是室外对照的33倍。建成一所经过装饰的实验室，空气中甲醛平均浓度高达0. 5mg/立方米，是室外的62.5倍。抽样检测发现单位及住户室内环境污染严重，查了 11家只有1户合格，其中竟有1户甲醛超标25倍。甲醛为较高毒性物质，当室内空气中甲醛含量为0. Img/立方米时，就有异味和不适感；达到0.5 mg/立方米时，可刺激眼睛，引起流泪；达到0.6 mg/立方米时，可引起咽喉不适或疼痛。浓度更高时，可引起恶心呕吐，咳嗽胸闷，气喘甚至肺水肿；达到30 mg/ 立方米时，会立即致人死亡。长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、 结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制 DNA损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病 (sick-house)。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TDI、VOC等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。植物具有净化空气，改善环境的作用。已有研究表明外源甲醛能够作为碳源被整合入植物光合细胞的代谢中。比如，普通的挂兰在mC标记的甲醛上生长时通过一碳代谢产生mC标记的产物，如丝氨酸和卵磷脂。甲醛可以和谷胱苷肽，精氨酸，天冬酰氨和四氢叶酸形成加合物后通过不同的途径进行代谢。对几种真核生物的生化和遗传学研究表明谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶(FALDH)是甲醛代谢的关键酶之一。甲醛脱氢酶广泛存在于微生物和植物体的所有组织中，它催化的反应以甲醛和谷胱苷肽的加合物硫代羟甲基谷胱苷肽(S-hydroxymethylglutathione)为底物产生硫代甲酰基谷胱苷肽(S-formylglutathione)。在植物中还有硫代甲酰谷胱苷肽水解酶，它能把^-formylglutathione分解为甲酸和谷胱苷肽。这两个酶组成一条甲醛到甲酸的氧化途径。 Achkor等人为了检测甲醛脱氢酶的功能，对来源于拟南芥FALDH的基因进行遗传操作，得到了不同FALDH水平的拟南芥转基因株系。过量表达此酶的拟南芥对外源甲醛的摄取效率提高25%，FALDH水平降低的植物(由于共抑制表型或者反义表达)和野生型拟南芥相比， 甲醛脱毒速率显著缓慢，能力下降。这些结果表明植物吸收甲醛的能力与FALDH活力水平相关(Achkor 等，Plant Physiol, 2003，132(4) 2248-2255)。综上所述，高等植物都拥有甲醛代谢途径，但其甲醛代谢关键酶在高等植物中表达水平较低，稳定性差，使植物无法应对外界环境中高浓度甲醛的胁迫，如何提高植物吸收耐受及代谢甲醛的能力就成为本领域的技术人员尤为关注的问题。很多研究结果说明来自耐热性微生物的酶稳定性好，应用范围广，作用效果好。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的目的是提供一种稳定性好，同时能提高植物吸收、代谢和耐受甲醛能力的短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因/WA序列及分离克隆该基因的引物序列，用该基因转化植物，使之提高对甲醛的吸收、代谢和耐受能力，克服植物本身甲醛代谢关键酶表达水平较低，吸收代谢甲醛能力低的缺点。为了实现上述目的，本专利技术从耐热甲基营养短芽孢杆菌iffreviBacillus brevis, 1.931)中克隆甲醛脱氢酶基因/WA，其编码区由1134个碱基组成，具有序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。本专利技术的faldh基因编码FALDH蛋白，它由377个氨基酸残基组成，具有序列表SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。本专利技术的基因/WA在植物中表达的 FALDH蛋白可以提高其对甲醛的吸收、代谢和耐受性。本专利技术提供的上述基因序列是一种能氧化甲醛的新的甲醛脱氢酶基因，用该基因转化植物，提高其甲醛吸收和代谢能力，并克服它们自身对甲醛耐受力低的缺点。本专利技术另一目的是提供甲醛脱氢酶基因的植物表达载体pK2-35S-/aA/A，所述载体含有甲醛脱氢酶/WA基因及卡那霉素筛选标记基因K2和组成型启动子35S。本专利技术另一目的是将甲醛脱氢酶基因的植物表达载体VhHldh应用在制备吸收和耐受甲醛能力强的转基因植物中。本专利技术更详细的技术方案由下述描述揭示1、在短芽孢杆菌1. 931菌株中进行/WA基因的克隆本专利技术所提供的甲醛脱氢酶基因来源于耐热甲基营养菌短芽孢杆菌，首先对相近微生物禾中(包括 Escherichia coli K-12, Paracoccus deni tr if leans, Pho tobac terium dams e Iae subsp. Piscicidaj Pichia ρ as tor is, Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1) 脱氢酶氨基酸序列比对找到氨基酸保守序列，根据该保守序列设计简并引物扩增得到甲醛脱氢酶基因的部分核苷酸序列，然后将得到的部分核苷酸序列在GenBank中比对，根据同源性最高物种的核苷酸序列设计特异引物扩增得到全长基因的方法克隆得到，具体克隆方法如下(1)从GenBank中查找相近物种甲醛脱氢酶基因的氨基酸序列，根据氨基酸保守序列设计序列如下的一对简并引物fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGAfid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC 以短芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增，得到faldh基因的部分片段fid ；(2)回收并纯化/WA基因的部分片段/A/，并将其连接到PMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-/7i/，将正确的重组质粒送测序公司测序；(3)、将faldh基因的部分序列/7^/在NCBI上进行比对，根据同源性最高的短小芽孢杆 mBacillus pumiIus)的甲醛脱氢酶基因序列设计序列如下的一对特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因，其特征在于甲醛脱氢酶基因具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示核苷酸序列或编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示氨基酸序列的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：年洪娟，陈丽梅，孟庆超，程琴，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53
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