天然抑芽剂的制备方法及其在烤烟腋芽抑制上的应用技术

本发明专利技术公开了用于烤烟腋芽抑制的天然抑芽剂，从植物中采集、分离、纯化培养，选拔生物活性强，产率高的株系，进行小麦抑芽快速检测，再反复比较筛选出高产菌株，再经培养、溶剂萃取、浓缩、干燥而得天然脱落酸（ＡＢＡ）和Ｂｏｔｃｉｎｏｌｉｄｅ两种抑芽剂。将其用于烤烟腋芽的抑制上，有效率达８９～９２％，整个加工过程安全无毒，不含有机合成成份，因而不污染环境、无残毒，生产成本低，价格便宜，也可用于花卉、蔬菜保鲜，调控作物生育，改善品质提高产量等。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

Method for preparing natural bud inhibitor and application thereof in inhibiting axillary bud of flue cured tobacco

The invention discloses a natural inhibitor of flue-cured tobacco axillary bud inhibition, collected, isolated and purified from the plant, the selection of high biological activity, high yield strains of wheat sprout, rapid detection, and then repeatedly screened out high yield strains, then after incubation, solvent extraction, concentration, drying and natural shedding acid (ABA) and Botcinolide two suckercides. For the inhibition of flue-cured tobacco axillary buds, the effective rate was 89 ~ 92%, the whole process is safe and non-toxic, does not contain organic synthetic ingredients, and no environmental pollution, no residue, low production cost, the price is cheap, can also be used for flowers, vegetables, regulation of crop growth, improve the quality of increasing output.

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及天然抑芽剂的制备方法及其在烤烟腋芽抑制上的应用，属于生物
尤其是天然脱落酸S-(+)-ABA，简称ABA，5-(1-羟基-2，-6，6-三甲基-4-氧代-2-环己烯-1-基)-3-甲基-2-顺-4-反-戊二烯酸，及Botcinolide，即4-羟基-2-辛炔酸，两种产品均是Botrytis cinerea PersrCGMCC NO.0357-1、NO.0357-2真菌的代谢产物(保藏日为1998年9月3日)。烟叶在我国许多省份种植面积大、经济效益明显。但每年田间管理中的封顶打杈，极其劳累费力，且摘除后不长时间，又会长出新的杈芽。为了提高烟叶产品产量、质量及减少劳力，国家先后从国外购入抑芽用的Flumetralin(抑芽敏)、Maleichydrazide(抑芽丹、芽敌)、除芽通等，这些药品用于田间管理，抑芽效果各有特色，但价格较高(13元/亩)，而且它们都是有机合成制剂，对烤烟品质的影响及残留毒性、环境污染等问题尚未得到解决。本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足及弊端，提供一种安全无毒、无副作用、不污染环境、无残毒顾虑、效高价廉的新型抑芽剂。上述目的是这样实现的从植物中广泛采集Botrytis Cinerea Persr的真菌病害标本，选择新鲜症状典型的标本，进行表面消毒，用灭菌水冲洗，再用组织分离或直接孢子振落法，进行单孢分离、纯化培养，然后按照室内菌株筛选及生产工艺流程方法，选拔生物活性强，产率高的株系(产率在0.8‰以上，小麦抑芽快速检测试验，抽提物稀释至1500倍仍然有效的菌株)，再反复比较筛选出高产菌株，产率0.9‰～1.5‰，最后依序编号，正式将菌种接入煮至半熟灭菌大麦粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存备用。培养基为PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培养7天，然后加入溶剂萃取、过滤、浓缩干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱内保存备用。将所得产物采用抑制小麦胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选，将预先提取待测粗抽品稀释10倍、50倍、100倍……系列浓度5ml分别移入放有处理过的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复3次，置26℃温箱中培养5～7天，筛选出活性强，产率高的菌株，培养所得粗品天然脱落酸(ABA)。再用柱层析和TLC法纯化、HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析，确定分子量和结构式，天然脱落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，结构式为 为了避免原料浪费，将萃取后的剩余水溶液再作处理。方法是萃取后的剩余水溶液调整PH为碱性，经EtOAC抽提分离出溶剂层和水层，再对水层调整PH值，经倍量溶剂抽提，再次分离出溶剂层和水层，弃去水层，将此次分离出来的溶剂收集，用水和饱和Nacl液洗后，无水Na2So4脱水，浓缩干燥，EtOAC可溶酸性馏份，得到天然脱落酸ABA。天然脱落酸的分子量为264.3，分子式C15H20O4。该物质结构具有5个特点①主核具有环状结构；②环状结构上必须有双键③主核具有一个侧链；④具有一个-COOH，羧基和主核间至少有一碳原子⑤主核和侧链必须具立体结构。另一种制备方法是从植物中广泛采集Botrytis Cinerea Persr的真菌病害标本，选择新鲜症状典型的标本，进行表面消毒，用灭菌水冲洗，再用组织分离或直接孢子振落法，进行单孢分离、纯化培养，然后按照室内菌株筛选及生产工艺流程方法，选拔生物活性强产率高的株系(产率在0.8‰以上，小麦抑芽快速检测试验，抽提物稀释至1500倍仍然有效的菌株)，再反复比较选出高产菌株，产率0.9‰～1.5‰，最后依序编号，正式将菌种接入煮至半熟灭菌大麦粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存备用。培养基为PDA，室温培养12天(如用谷糠23℃培养6天)然后加入溶剂萃取、过滤、浓缩干燥得Botcinolide的粗抽品，放在-80℃冰箱内保存备用。将所得产物采用抑制小麦胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选，将预先提取的待测粗抽品稀释10倍、50倍、100倍……系列浓度5ml移入放有处理过的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复3次，置26℃温箱中培养5～7天，筛选出活性强产率高的菌株来生产天然Botcinolide。再用柱层析和TLC法纯化、HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析，确定分子量和结构式，分子量是338，分子式C20H34O8，结构式为 将天然抑芽剂用于烤烟栽培过程的腋芽抑制上，采用涂抹或喷淋方式，达到了抑制烟芽疯长，收到了良好的效果。该抑芽剂也可用于其他植物的封顶打杈。花卉、蔬菜保鲜，调控作物生育，改善品质提高产量等。天然抑芽剂由于是从植物中采集、分离、培养、萃取、过滤、干燥而得，整个加工过程安全无毒，不含有机合成成份，因而不污染环境、无残毒，生产成本低，价格便宜，每亩成本仅需8～9元，又能增进烤烟品质，抑芽效果平均在90％以上。该抑芽剂也可用于其他植物的封顶打杈。花卉、蔬菜保鲜，调控作物生育，改善品质提高产量等。下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详述附图说明图1为天然抑芽剂的制备方法工艺流程2为天然脱落酸ABA剩余水溶液的抽提工艺流程3为天然抑芽剂(抑1、抑2)与对照组在田间应用示意图首先从自然界各种植物(果树、蔬菜、花卉、粮食、经济作物、野生林木……等)中采集Botrytis Cinere Persr的真菌病害标本，然后选择新鲜、症状典型的标本，进行表面消毒，用灭菌水冲洗，进行单孢分离、纯化培养，采用小麦抑芽试验法，筛选具有生物活性的菌株，再从有活性的菌株群中反复筛选比较，寻找活性物质产出率最高的菌株作为菌种保存。例如，我们从莴苣、葱、草莓、酸木瓜等植物的灰霉病中分离到的7个菌株，按照前述方法分离培养、萃取、浓缩，即可得到粗产品，提供生测试验。培养基为PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培养7天，然后加入溶剂萃取、过滤、浓缩干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱内保存备用。将所得产物采用抑制小麦胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选，将预先配制好的标准及待测粗抽品稀释10倍、50倍、100倍……系列浓度5ml移入放有处理过的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复3次，置26℃温箱中培养5～7天，筛选出活性强产率高的天然脱落酸(ABA)。再用柱层析和TLC法纯化、HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析、分子量和结构式，天然脱落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，结构式为 为了避免原料浪费，将萃取后的剩余水溶液再作处理。方法是萃取后的剩余水溶液调整PH为碱性，经EtOAC抽提分离出溶剂层和水层，再对水层调整PH值，经倍量溶剂抽提，再次分离出溶剂层和水层，弃去水层，将此次分离出来的溶剂收集，用水和饱和Nacl液洗后，无水Na2So4脱水，浓缩干燥，EtOAC可溶酸性馏份，得到天然脱落酸ABA。另一种制备方法是将筛选出来产率高的菌种，用PDA培养基，室温培养12天，如果用谷糠作培养基，23℃培养6天，然后用倍量乙酸乙脂浸提24小时(注意振摇)，过滤、浓缩，再用苯浸提浓缩，即得到天然抑芽剂Botcinolide。再用柱层析和TLC法纯化、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种天然抑芽剂的制备方法，其特征在于：ａ、从植物中广泛采集Ｂｏｔｒｙｔｉｓ Ｃｉｎｅｒｅａ Ｐｅｒｓｒ真菌ＣＧＭＣＣ ＮＯ．０３５７－１的病害标本，选择新鲜症状典型的标本，进行表面消毒，用灭菌水冲洗，再用组织分离或直接孢子振落法，进行单 孢分离、纯化培养，然后按照室内菌株筛选及生产工艺流程方法，选拔生物活性强产率高的株系（产率在０．８‰以上，小麦抑芽快速检测试验，抽提物稀释至１５００倍仍然有效的菌株），再反复比较选出高产菌株，产率０．９‰～１．５‰，最后依序编号，正式将菌种接入煮至半熟灭菌大麦粒上，放入－４０℃～－６０℃冰箱保存备用。ｂ、培养基为ＰＤＡ、ＰＬＤ、ＰＤＡ＋柑桔皮粉，在２５℃培养７天，然后加入溶剂萃取、过滤、浓缩干燥得天然ＡＢＡ粗抽品，放在－８０℃冰箱内保存备用，ｃ、将所得产物采用抑制小麦 胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选，将预先配制好的标准ＡＢＡ液及待测粗抽品稀释１０倍、５０倍、１００倍……系列浓度５ｍｌ分别移入放有处理过的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复３次，置２６℃温箱中培养５～７天，筛选出活性强，产率高的菌株培养所得粗品天然脱落酸（ＡＢＡ），ｄ、再用柱层析和ＴＬＣ法纯化、ＨＰＬＣ分析，应用ＩＲＶ、ＵＶ、ＭＳ；结合ＨＮＭＲ仪器解析，确定分子量和结构式，天然脱落酸的分子量是２６４．３，分子式Ｃ↓［１５］Ｈ↓［２０］Ｏ↓［４］， 结构式为＊＊＊。...

【技术特征摘要】
1.一种天然抑芽剂的制备方法，其特征在于a、从植物中广泛采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCC NO.0357-1的病害标本，选择新鲜症状典型的标本，进行表面消毒，用灭菌水冲洗，再用组织分离或直接孢子振落法，进行单孢分离、纯化培养，然后按照室内菌株筛选及生产工艺流程方法，选拔生物活性强产率高的株系(产率在0.8％以上，小麦抑芽快速检测试验，抽提物稀释至1500倍仍然有效的菌株)，再反复比较选出高产菌株，产率0.9‰～1.5‰，最后依序编号，正式将菌种接入煮至半熟灭菌大麦粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存备用。b、培养基为PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培养7天，然后加入溶剂萃取、过滤、浓缩干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱内保存备用，c、将所得产物采用抑制小麦胚芽鞘生长法，进行快速生测筛选，将预先配制好的标准ABA液及待测粗抽品稀释10倍、50倍、100倍……系列浓度5ml分别移入放有处理过的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复3次，置26℃温箱中培养5～7天，筛选出活性强，产率高的菌株培养所得粗品天然脱落酸(ABA)，d、再用柱层析和TLC法纯化、HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析，确定分子量和结构式，天然脱落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，结构式为2.一种天然抑芽剂的制备方法，其特征在于a、从植物中广泛采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCC NO.0357-2的病害标本，选择新鲜症状典型的标本，...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈嘉祥，陈志，
申请(专利权)人：云南农业大学和昆明恒溢隆经贸有限责任公司，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]