猪雌激素受体基因快速分型试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRM?PCR预混液和Nuclease-free?dH2O。本发明专利技术还提供一种猪雌激素受体基因快速分型检测方法；本发明专利技术方法通量大，一次可以同时对96或者384个样本进行基因分型检测，适用于猪雌激素受体基因的大规模筛查，特别适用于大型商业猪场。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于生物

技术介绍
雌激素(estrogen)主要是由卵泡的颗粒细胞和内膜细胞合成与分泌的，在动物繁殖过程中具有重要的生理作用。1994年，Rothschild等发现雌激素受体基因(estrogen receptor, ESR)是猪产仔数性状的主效基因或与产仔数主基因紧密连锁的基因，将猪的雌激素受体基因定位于猪1号染色体的PM P25区域，并在PvuII酶切位点上将该基因分为AA、BB和AB三种基因型，分析发现BB基因型为产仔数有利基因型，比AA型母猪总产仔数和产活仔数分别高出1. 40 3. 37头和0. 63 3. 58头。后来研究表明，雌激素受体基因的PvuII酶切多态性是由于该基因T1665G点突变造成的。雌激素受体基因作为影响猪产仔数的主效基因已经广泛用于猪的标记辅助选择(Marker-assisted selection)，据欧盟 2008年统计数据显示，在欧盟25国，每年有120 480万只猪接受雌激素受体基因的筛选， 在中国虽然没有详细的统计调查，但是雌激素受体基因标记辅助选择也广泛应用于各大商业猪场。随着雌激素受体基因标记辅助选择的普及，迫切需要一种高效率，高通量且高准确率的技术来解决如此庞大规模的基因分型。高分辨率熔解(High Resolution Melt,HRM)是一种最新的遗传学分析方法，主要是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。主要是依赖于精确的检测DNA双链熔解荧光曲线，如同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，从而对样品进行检测，HRM源于熔解曲线，原理与普通熔解曲线分析是一致的，二者不同之处主要表现在升温速率和所用的染料。HRM用的是饱和染料(dyeEvaGreen)，高浓度的染料饱和了 DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法(检测位点多，样本少)的高通量方法。HRM检测SNP是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。HRM的特点和优势是无需序列特异性探针；操作简便、快速，使用成本低；可对未知位点进行筛查；较高通量；高灵敏度；特异性、重复性好；适用范围广。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。对于猪雌激素受体基因T1665G突变进行基因分型的传统方法有聚合酶链式反应结合限制性内切酶片段长度多态性法(PCR-RFLP)，聚合酶链式反应结合单链构象多态性法(PCR-SSCP)，其中PCR-RFLP法最为常用，该方法通常按照以下步骤进行步骤一、对待检样本进行预处理，提取基因组DNA ；步骤二、特异性引物的制备设计和合成上、下游引物一对，用于PCR扩增特定片断(片段必须包括雌激素受体基因的1665位点)；步骤三、PCR扩增目DNA片段；步骤四、根据扩增片段上的限制性酶切位点，用特异的限制性内切酶对扩增片段进行酶切；步骤五、对酶切产物进行凝胶电泳检测，分析待测样本的基因型。PCR-RFLP 法由于步骤繁琐且酶切反应后需要进行凝胶电泳检测，使其耗时长、通量小且准确性受主观因素影响，一直很难适用于大规模的雌激素受体基因筛选。仅对单个样本进行检测，传统的PCR-RFLP法需要14 16小时，如果对于大批量的样本进行扫描分型，工作量和耗时都是无法想象的。
技术实现思路
本专利技术旨在克服上述传统方法的技术缺陷，基于HRM技术，提供一种。该方法通量大，特异性强，重复性好，准确率高且鉴定简便快捷。本专利技术中的这种猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、 HRMPCR 预混液和 Nuclease-free dH20。其中引物预混液混合液中两条引物浓度均为10 μ M，引物序列如下上游引物GCAGAATCAAGTTTTATGAGACCA；下游引物CGAGGGTCAGTCCAATTAGAA；HRM PCR预混液成分及体积比例如下HotStar Taq DNA Polymerase (5U / μ 1) 10XPCR Buffer (Mg2+Plus) dNTPMixture (各 2. 5mM) EvaGreen dye (1. 2 μ Μ) = 1 1 2 6。本专利技术提供的一种猪雌激素受体基因快速分型检测方法，包括以下步骤步骤1 将引物预混液、HRM PCR预混液、Nuclease-free dH20以及提前抽提好的 DNA样本从_20°C冰箱中取出并在冰上融化；步骤2 配制反应预混液；预混液体积根据待检样本的数量而定；步骤3 将反应预混液混合均勻，并根据所需的体积分装到PCR管中；步骤4 向分装好反应预混液的PCR中添加样本DNA模板，并轻轻混勻；步骤5 根据优化程序，调置好荧光定量仪的工作程序；步骤6 将配制好的PCR管放到荧光定量PCR仪上，启动HRM程序；步骤7:数据分析本专利技术利用高分辨率溶解曲线技术，结合优化设计的引物和反应程序，能够准确地对待测样本进行雌激素受体基因分型，通过详细的测试，本方法的准确率为98. 33%，高于传统的 PCR-RFLP 法(98. 00% ).该专利技术高效迅速，操作步骤简单，只需要一个PCR反应和半个小时的溶解曲线分析即可完成，大大缩短了雌激素受体基因分型所需要的时间。对于单个样本，传统的 PCR-RFLP法需要12-16小时，而本方法将所需时长缩短到2小时以内。本专利技术方法价格与传统PCR-RFLP法相当，所需费用不到2. 5元/样品，而传统的方法也需要约2.1元/样品。本专利技术的方法完全闭管操作，可以避免繁琐的开管操作带来的外源污染，大大降低了假阳性结果的出现。本专利技术方法通量大，一次可以同时对96或者384个样本进行基因分型检测，适用于猪雌激素受体基因的大规模筛查，特别适用于大型商业猪场。附图说明图1为标准化后的溶解曲线图；图2为用本专利技术中特异性引物对雌激素受体基因三种基因型进行扩增后的溶解峰3为15个猪DNA样品的雌激素受体基因分型结果。 具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例1猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其试剂包括引物预混液、HRM PCR预混液和 Nuclease-free dH20o其中引物预混液混合液中两条引物浓度均为10 μ M，引物序列如下上游引物GCAGAATCAAGTTTTATGAGACCA；下游引物CGAGGGTCAGTCCAATTAGAA；HRM PCR预混液成分及体积比例如下HotStar Taq DNA Polymerase (5U / μ 1) 10XPCR Buffer (Mg2+Plus)本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种猪雌激素受体基因快速分型试剂盒，其特征在于，包括引物预混液、ＨＲＭＰＣＲ预混液和Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｄＨ２Ｏ；其中所述引物预混液：混合液中两条引物浓度均为１０μＭ，引物序列如下：上游引物：ＧＣＡＧＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡ；下游引物：ＣＧＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴＴＡＧＡＡ；所述ＨＲＭ　ＰＣＲ预混液：成分及体积比例如下：ＨｏｔＳｔａｒ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）∶１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋Ｐｌｕｓ）∶ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）∶ＥｖａＧｒｅｅｎ　ｄｙｅ（１．２μＭ）＝１∶１∶２∶６。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马继登，李明洲，李学伟，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：51