本发明专利技术公开了一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体及其制备方法以及在肝细胞培养方面的应用。所述的壳聚糖/RGD三维多孔微载体是以壳聚糖和RGD为原料，即将壳聚糖与RGD的混合溶液通过高压脉冲微胶囊成型仪，在高压作用下，滴入溶有RGD的多聚磷酸钠溶液中形成微球后，再经过冷冻干燥制孔，最终形成具有三维结构的壳聚糖/RGD多孔微载体。本发明专利技术的这种壳聚糖/RGD三维多孔微载体，孔径为20-50mm，粒径为400-900mm，孔隙率为91%；同时RGD的加入有效地提高了壳聚糖的生物相容性，适合肝细胞在该微载体上高密度、高活性地生长。本法工艺简单，操作简捷。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于多孔材料材料制备领域，涉及一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体及其制备方法和在肝细胞培养方面的应用。
技术介绍
目前，无论是实验室还是工业生产上，所使用的细胞培养微载体主要是实心 Cytodex系列的载体，且属于单层单层培养方式。而在体内，组织和细胞的生长发育过程是在三维立体的内环境条件下进行的，细胞和细胞基质以及细胞之间的相互信号传递对于调解细胞的增殖、分化有着重要影响，常规的体外单层培养方法不能提供组织正常生长发育所需的三维环境条件，因而制备三维微载体就具有十分重要的意义。壳聚糖是一种天然高分子惰性正电荷多糖，在生物医学方面尤其作为组织工程植入材料具有广泛的应用前景。而多聚磷酸钠/壳聚糖复合膜的拉伸强度显著高于纯壳聚糖膜。梁凯1等将充分溶胀的壳聚糖膜置于一定浓度的三偏磷酸钠溶液中进行交联反应制备得到三偏磷酸钠/壳聚糖复合膜，当三偏磷酸钠的浓度为0. llmol/L时，交联膜的干态抗张强度达到83. 74MPa,与纯壳聚糖膜相比提高了 44. 81%。目前的微载体肝细胞培养方面多用的是实心微载体，只能对细胞进行单层培养， 培养的细胞量小，且有的微载体的形状不是球形，则微载体的比表面积小，相应的培养的细胞的量也会减小。参考文献1梁凯，杜予民，李艳，张婷.三偏磷酸钠交联壳聚糖膜的制备及其性能研究J.分析科学学报，2008，M O) 136-140。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述的技术问题而提供一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体及其制备方法和其在肝细胞培养方面的应用。本专利技术的技术方案一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体，原料包括壳聚糖，其特征在于所述的原料还包括 RGD,即将壳聚糖与RGD通过高压脉冲微胶囊成型仪形成微球后，再经过冷冻干燥制孔，即将微球中的水凝结成细小的冰晶，使冰晶升华形成微小的孔，最终形成具有三维结构的壳聚糖/RGD三维多孔微载体；其中所述的壳聚糖的分子量为5. 63X IO6,脱乙酰度为91% ；RGD即精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸所形成的三肽。上述的一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体的制备方法，包括如下步骤 (1)、RGD/壳聚糖醋酸溶液和RGD/多聚磷酸钠溶液的制备RGD/壳聚糖醋酸溶液的制备将RGD与所述的壳聚糖醋酸溶液按RGD与壳聚糖醋酸溶液中的壳聚糖的质量比即RGD:壳聚糖醋酸溶液中的壳聚糖为2. Og 2. 5g进行混合即得RGD/壳聚糖醋酸溶液；其中壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖与浓度为1% (V/V)的醋酸水溶液按质量体积比计算即壳聚糖醋酸水溶液为2. 5g :100ml ；RGD/多聚磷酸钠水溶液的制备将RGD与多聚磷酸钠水溶液按RGD与多聚磷酸钠溶液中的多聚磷酸钠的质量比即RGD 多聚磷酸钠为2. 0:4. 5进行混合即得RGD/多聚磷酸钠水溶液；其中的多聚磷酸钠水溶液中，按质量体积比计算，即多聚磷酸钠水为4. 5g: IOOml ；(2)、高压静电脉冲成球将步骤(1)中的③所得的RGD/壳聚糖醋酸溶液和RGD/多聚磷酸钠水溶液在高压静电微胶囊成型仪中进行高压静电脉冲制备微球，所得的微球在RGD/多聚磷酸钠水溶液中浸泡4h后，用去离子水清洗微球直至溶液为中性，得到白色实心微球；高压静电脉冲过程控制电压为39-50kv，推进速度为90mm/h，脉宽为7ms，频率为90Hz， 液面距为20mm ；(3)、冷冻干燥制备壳聚糖/RGD三维多孔微载体将步骤(2)所得的白色实心微球放入冻干机中进行冷冻干燥来制孔，冷冻干燥过程控制预冻温度为-80°C，预冻时间为Ih ；—次干燥的温度为-30°C，时间为9-10h ；二次干燥的温度为10°C，时间为1. 5-池，最终得壳聚糖/RGD三维多孔微载体。 上述所得的壳聚糖/RGD三维多孔微载体用于肝细胞贴壁培养，其培养方法包括如下步骤(1)、壳聚糖/RGD三维多孔微载体的预处理将壳聚糖/RGD三维多孔微载体浸入浓度为70%的乙醇水溶液中，在4°C的温度环境中保持他，然后滤出壳聚糖微载体，并用去离子水清洗3次，之后再用配制好的pH=7的PBS缓冲液淋洗1次，再将壳聚糖微载体浸入PBS缓冲液中，4°C的温度环境中保持12h，再次滤出壳聚糖/RGD三维多孔微载体微载体，并用PBS缓冲液反复清洗3次；所述的PBS缓冲液，即取磷酸二氢钾0.68 g加0. lmol/L氢氧化钠溶液四.1ml，用水稀释至100 ml，即得；(2)、肝细胞的接种和培养在48孔板上按5 X IO6每孔的细胞接种密度将人肝细胞接种于步骤(1)经预处理后的壳聚糖/RGD三维多孔微载体中，将48孔板轻轻摇晃IOmin后转移至温度为37°C，二氧化碳浓度为5%，湿度为100%的二氧化碳培养箱中进行黏附培养4h后，用含血清的RPMI1640 培养液冲洗壳聚糖/RGD三维多孔微载体以除去未在壳聚糖/RGD三维多孔微载体上黏附紧密的肝细胞，再将黏附肝细胞的壳聚糖/RGD三维多孔微载体转移至M孔培养板，每孔加入 Iml含血清的RPMI1640培养液进行培养，培养4个小时后，即得含有壳聚糖/RGD三维多孔微载体与肝细胞复合体的培养液，之后每1-2天更换含血清的RPMI1640培养液一次，培养 4天后再将含有壳聚糖/RGD三维多孔微载体与肝细胞复合体的培养液进行离心分离，控制离心转速为lOOOr/min，时间5min，取上层溶液，即可得到高密度、高活性的肝细胞；所述的含血清的RPMI1640培养液的配制，即将血清与RPMI1640按质量比即血清 RPMI1640为1:9混合后，加入抗生素青霉素和链霉素，二者的最终浓度均为100U/ml，用步骤(1)中所述的PBS缓冲溶液调节pH在7. 0-7. 2之间，然后过滤除菌，4°C保存备用。本专利技术的技术效果本专利技术的一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体，由于其制备过程中通过高压脉冲在壳聚糖微球表面覆着具有生物活性的RGD三肽序列，形成材料类细胞外基质功能性复合层，达到对细胞亲和性能改善的目的，提高壳聚糖的生物相容性，且制备过程中采用冷冻干燥法制孔，以水做致孔剂，对细胞没有毒性，使得该载体用于肝细胞培养时，肝细胞能够在微载体上高密度、高活性的生长。且该载体的制备方法操作简单，可控性强，其孔径为20-50mm， 粒径为400-900_，孔隙率为91%。另外，本专利技术的本专利技术的一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体制备过程中采用多聚磷酸钠为交联剂制备微球，从而增强了微球的机械性能。同时，由于在壳聚糖和多聚磷酸钠溶液中均加入RGD，增强溶液的电负性，易于微球的沉积，并可增强微球的机械性能。附图说明图1是本专利技术本专利技术壳聚糖/RGD三维多孔微载体的扫描电镜图片； 图2是本专利技术中人肝细胞在微载体表面的荧光标识照片。具体实施例方式下面通过实施例并结合附图对本专利技术进一步说明，但并不限制本专利技术。本专利技术所用的人肝细胞，是正常人肝细胞系L-02，中国科学院上海细胞生物学研究所；本专利技术所用的RPMI1640培养液，购自北京索莱宝科技有限公司； 所用的血清为胎牛血清，购自杭州四季青有限公司； 其他各种原料或试剂均为分析纯，来自上海国药集团。本专利技术所用的冻干机，型号为ES，仪器名字为Advantage PLUS冷冻型干燥机，生产厂家为美国Virtis公司；本专利技术所用的高压静电本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种壳聚糖／ＲＧＤ三维多孔微载体，其原料包括壳聚糖，其特征在于所述的原料还包括ＲＧＤ，即将壳聚糖与ＲＧＤ混合溶液通过高压脉冲微胶囊成型仪形成微球后，再经过冷冻干燥制孔，最终形成具有三维结构的壳聚糖／ＲＧＤ三维多孔微载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李琳，刘宝林，韩宝三，杨波，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：31
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