本发明专利技术公开了改造的sacB基因及其衍生的整合型载体，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供的整合型载体含有一个人工合成的强启动子PlacM启动的能在棒状杆菌中良好转录表达并具有条件致死功能的基因sacB；一个用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因；还含有一个多克隆位点MCS。SacB处于强启动子PlacM和优化的SD下，表达更加良好；此外，由于sacB自身的启动子、sacR和SD序列均被去除，应用时几乎不会出现蔗糖抗性、抗生素抗性的菌落，大大减少应用中不必要的麻烦。该载体能在大肠杆菌中复制并稳定存在而不能在棒状杆菌中复制，适用于棒状杆菌染色体基因敲除和替代。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改造的基因及依托其构建的整合型载体，特别是一种改造的sacB 基因及其衍生的整合型载体。
技术介绍
随着棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识的大量累积，基于理性设计的代谢工程育种在氨基酸高产菌株选育中的地位越来越重要。基因敲除和替代技术是棒状杆菌代谢工程育种研究中主要分子生物学技术之一。基因敲除和替代技术是自80年代未以来发展起来的一种分子生物学技术，通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失或被其他替代的。一般是利用微生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的DNA片段与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组，从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点来调节代谢流，优化代谢途径，最终达到微生物育种的目的。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) sacB基因编码的果聚糖蔗糖酶，是枯草芽孢杆菌的一种外分泌酶，它受蔗糖诱导表达，能将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，还可进一步将果糖聚合成果聚糖。在培养基中存在蔗糖的条件下，细胞内果聚糖蔗糖酶的表达对革兰氏阴性菌有致死作用(Gay, P.，Le Coq, D, Steinmetz, M.，Berkelman, T.，Kado, C. I.，1985. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elemems in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164，918-21.)。在培养基中存在蔗糖的条件下， 细胞内表达果聚糖蔗糖酶，对棒杆菌属、分枝杆菌属两种革兰氏阳性菌也具有致死作用 (Pelicic. V.，Reyrat, J. M.，Gicquel, B.,1996. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. J Bacteriol· 178，1197—9 ; Schafer, A.，Tauch, Α.，Jager, W.，Kalinowski，J.，Thierbach，G.，Puhler，Α.，1994. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19 :selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 145，69-73.)。基于这一发现，Schafer 等用 sacB 基因作为一个条件致死型标记，发展了一种携带抗生素抗性与sacB双标记的新型整合型载体。基于双标记的pKlSmobsacB能够对谷氨酸棒状杆菌染色体基因实施进行无痕敲除及替代。该载体使用sacB自身的启动子和SD序列，限制了应用范围；应用该载体进行基因敲除时，由于IS插入片段的插入，不同比例的出现蔗糖抗性、抗生素抗性的菌落，给实验带来不必要的麻烦。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种改造的sacB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述sacB基因用作筛选标记亦为本专利要求的保护范围。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种依托改造的sacB基因构建的整合型载体，含有优化的组合启动子PlacM及SD序列、改造的sacB基因、多克隆位点MCS及抗生素筛选标记，以消除蔗糖抗性、抗生素抗性的问题，大大减少应用中不必要的麻烦。其中，sacB 自身的启动子、sacR和SD序列均被去除，处于优化的组合外源PlacM和SD序列下，表达更加良好。多克隆位点MCS，含有多个限制性内切酶切位点，位于外源启动子PlacM及SD序列上游。所述的整合型载体pDXW-3，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。本专利技术中，sacB处于强启动子PlacM和优化的SD下，表达更加良好。另外，sacB 自身的启动子、sacR和SD序列均被去除，应用时几乎不会出现蔗糖抗性、抗生素抗性的菌落，大大减少应用中不必要的麻烦。因此本专利技术即获得了一个能在棒状杆菌广泛，高效的整合型载体。附图说明图1整合型载体pDXW-3的物理图谱具体实施例方式实施例1改造的sacB基因一种改造的sacB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。实施例2整合型载体pDXW-3的构建以 B.subtilis subsp. 168 (购自 ATCC 23857)基因组为模板，PlacM-sacB-F 和 PlacM-sacB-R为引物，通过PCR扩增1605bp的sacB基因，在扩增产物的5 ’和3 ’末端引入限制酶NheI和NcoI酶切位点，PCR产物用NheI和NcoI酶切。pDWX_l (构建方法参考Xu，D.， Tan,Y. ,Li,Y. ,ffang,X. ,2011. Construction of a hovel promoter-probe vector and its application for screening strong promoter for Brevibacterium flavum metabolic engineering. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27,961-968.)同样用 NheI和NcoI酶切；两者连接，由此产生的质粒大小为5067bp，命名为pDXW_3。以上所述的PCR扩增所需引物序列PlacM-sacB-F :aaatt_gctagctgagetgtttacaattaatcatcgtgtggtaccatgtgtggaatt ggaaaggacttgaacgatgaacatcaaaaagtt ^ lzIzl Τ*^1lJ^"rP^ NheI ^ ^0PlacM-sacB-R :agta￡￡^ggaaaaggttaggaatacggttagcca 其中下划线部分 NcoI 位点OPCR反应条件PCR反应退火温度57°C，延伸时间120s。整合型载体pDXW-3核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。实施例3载体pDXW-3在谷氨酸棒状杆菌中的应用评价为了证明pDXW-3的可用性，我们在谷氨酸棒状杆菌敲除aceE基因。以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，aceE-L-F/aceE-L-R和aceE-R-F/aceE-R-R分别为引物，通过PCR扩增到aceE基因的上游同源臂Larm和下游同源臂Rarm。aceE-L-F CACAGATCTGATTGTTAAGGCTTCTTGTTTCCACGCT，其中下划线部分为 BglII 位点aceE-L-R TCTATGACAGTGAGTACTCGAACGACAGCAAGCTTGATCGGCCATTTCCACACCTCC,其中下划线部分与引物aceE-R-F下划线部分互为反向互补序列aceE-R-F :TTGCTGTCGTTCGAGTACTCACTGT本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种改造的ｓａｃＢ基因，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，谭延振，徐大庆，李烨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。