PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法技术

PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法，它涉及DNA疫苗微球的制备方法。它解决了现在猪流感DNA疫苗存在持续时间短，在体内易被降解，不能缓释的问题。方法：一、PLGA溶于二氯甲烷中，加猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液，乳化后加聚乙烯醇，得复乳；二、复乳磁力搅拌后离心，收集微球并洗涤，再真空冷冻干燥即完成。本发明专利技术制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球大小均匀，外形圆整，表面光滑，粒径为6.08±2.34μm，包封率平均为60％±3.8％，载药量平均为5.5％±0.5％；在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，可以保持体内最佳的药物浓度，延长药物作用时间，实现了药物的缓释。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA疫苗微球的制备方法。
技术介绍
猪流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种猪的急性、传染性呼吸道疾病， 传播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴发。因为猪流感病毒亚型较多、抗原易发生变异和可在种间传播，给流感疾病的预防乃至人类的健康带来很多挑战。所以猪流感在人流感和禽流感之间发挥着关键性作用，具有重大的公共卫生意义。DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内，在体内表达相应抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，产生保护性免疫。目前，DNA疫苗大动物实验、 人体临床实验结果表明DNA疫苗存在着给药剂量较大，生物利用度低，免疫效果个体差异大，不够理想的缺点，极大地阻碍了 DNA疫苗的研究进展。因此如何增强DNA疫苗的免疫效果、诱导产生粘膜免疫等课题是当前DNA疫苗研究的国际热点。国外DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究发展十分迅速，取得了不少阶段性成果，有的已进入临床实验。国内DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究工作开展较少，尤其是猪流感DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究还尚未见有报道。DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究结果已经显示出了巨大的应用潜力，微球/纳米粒递送系统具有靶向作用，对DNA疫苗具有保护作用， 提高细胞转运效率，提高免疫效果并可经口服和鼻腔给药，诱导黏膜免疫等特点。因此，DNA 疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统是一个很好的递送系统，将促进DNA疫苗在畜牧业和临床的实际应用，届时用于预防、治疗、诊断动物和人的疾患，将拯救诸多病畜或病者的生命或延长其寿命，其经济效益和社会效益无疑是巨大的。目前，普通猪流感DNA疫苗的持续时间短，在体内易被降解，不能够实现缓释的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现在猪流感DNA疫苗存在持续时间短，在体内易被降解，不能缓释的问题，而提供了 PLGA (聚乳酸/羟基乙酸共聚物)猪流感DNA疫苗微球的制备方法。PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法按以下步骤制备一、称取25mg的PLGA溶于0. 75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA基因重组质粒DNA溶液，冰浴条件下超声乳化10s，得初乳，然后在转速为7000r/min的条件下加入20mL质量浓度为2%的聚乙烯醇，得复乳；二、复乳在转速为200r/min的条件下磁力搅拌5h，然后在转速为4000r/min的条件下离心lOmin，收集微球并用灭菌水洗涤3次，再置于-10 -50°C的条件下真空冷冻干燥，即完成PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备；其中步骤一 40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA 基因重组质粒DNA溶液中有2mg猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA ；步骤一中猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的浓度为120 μ g/mL。本专利技术以可生物降解材料聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体，以猪流感病毒 H3N2亚型HA基因重组质粒DNA为模型药物，采用复乳化-溶剂挥发法制备PLGA猪流感DNA 疫苗微球，通过考察超声乳化时间、乳化器搅拌速度、PVA的浓度、油相中PLGA的浓度(m/v) 和DNA疫苗与PLGA比例(mg/mg)等影响因素，筛选出了粒径适宜、载药量大、包封率高、药物稳定性好、工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、样品需要量少，较好保持了 DNA疫苗的活性、具有适宜释药速率的PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法，并且本专利技术中的处方和工艺也可放大到生产应用，因而对产业化的应用具有指导意义。本专利技术制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球大小均勻，外形圆整，表面光滑，粒径为 6. 08 士 2. 34 μ m，包封率平均为60 % 士 3. 8 %，载药量平均为5. 5 % 士 0. 5 % ；在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，可以保持体内最佳的药物浓度，并且延长药物作用的时间；因此，实现了药物的缓释、靶向给药，具有重要的理论价值和实际应用前景，用于动物体或人体一些流行性疾病的预防、治疗和诊断，市场规模巨大，必将创造巨大的经济效益。本专利技术制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球生物相容性和生物黏附性好，经黏膜免疫大大增强了猪流感疫苗的机体局部和全身的体液免疫及细胞免疫效果；同时克服了传统注射疫苗造成的顺应性差、注射器和针头导致感染、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，生产成本较低。 本专利技术制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球可用于猪流感免疫，经口服给药，按体重免疫注射给药，给药量为95 105 μ g/100 μ L。附图说明图1是具体实施方式一中PLGA猪流感DNA疫苗微球的扫描电子显微镜观察图；图2是具体实施方式一中超声时间对DNA疫苗稳定性的影响琼脂糖凝胶电泳图， 其中M泳道=DL 15000 Markers ； 1-6泳道超声乳化时间分别为0、6、8、0、12、14s ；图3是具体实施方式一中搅拌速度对DNA疫苗稳定性的影响琼脂糖凝胶电泳图， 其中 M 泳道=DL 15000 Markers ； 1-5 泳道搅拌速度分别为 0、6000、7000、8000、9000r/ min ；图4是Western blot检测蛋白在293T细胞中的表达情况，其中1泳道293T细胞对照，2泳道质粒DNA，3泳道PLGA猪流感DNA疫苗微球，4泳道空白PLGA微球；图5是免疫鼠血清中IgG抗体检测结果的曲线图，其中·表示裸DNA疫苗组， 表示PLGA微球疫苗试验组， 表示生理盐水对照组，▲表示空白微球。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法按以下步骤制备一、称取25mg的PLGA溶于0. 75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA基因重组质粒DNA溶液，冰浴条件下超声乳化10s，得初乳，然后在转速为7000r/min的条件下加入20mL质量浓度为2%的聚乙烯醇，得复乳；二、复乳在转速为200r/min的条件下磁力搅拌5h，然后在转速为4000r/min的条件下离心lOmin，收集微球并用灭菌水洗涤3次，再置于-10 -50°C的条件下真空冷冻干燥，即完成PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备；其中步骤一 40 μ 1猪流感病毒Η3Ν2亚型HA 基因重组质粒DNA溶液中有2mg猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA ；步骤一中猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的浓度为120 μ g/mL。猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒按以下步骤构建根据对猪流感病毒四川分离株HA基因的分析，采用primer软件设计一对特异性扩增引物，上游 PBl :5，-GTGGTACCATGAAGACTATCATTGCTTTGAG-3，；下游 PB2 :5’ -TTGCG GCCGCTTACTAATACACT-CAAATG-3，。在其中分别引入KpnI和NotI酶切位点(加下划线部分)。采用PCR方法，以重组质粒pMD-HA为模板，扩增出猪流感病毒四川分离株HA基因； PCR反应参数为先95 °C预变性4min ；后94°C变本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．ＰＬＧＡ猪流感ＤＮＡ疫苗微球的制备方法，其特征在于ＰＬＧＡ猪流感ＤＮＡ疫苗微球的制备方法按以下步骤制备：一、称取２５ｍｇ的ＰＬＧＡ溶于０．７５ｍＬ的二氯甲烷中，待完全溶解后加入４０μｌ猪流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型ＨＡ基因重组质粒ＤＮＡ溶液，冰浴条件下超声乳化１０ｓ，得初乳，然后在转速为７０００ｒ／ｍｉｎ的条件下加入２０ｍＬ质量浓度为２％的聚乙烯醇，得复乳；二、复乳在转速为２００ｒ／ｍｉｎ的条件下磁力搅拌５ｈ，然后在转速为４０００ｒ／ｍｉｎ的条件下离心１０ｍｉｎ，收集微球并用灭菌水洗涤３次，再置于－１０～－５０℃的条件下真空冷冻干燥，即完成ＰＬＧＡ猪流感ＤＮＡ疫苗微球的制备；其中步骤一４０μｌ猪流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型ＨＡ基因重组质粒ＤＮＡ溶液中有２ｍｇ猪流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型ＨＡ基因重组质粒ＤＮＡ；步骤一中猪流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型ＨＡ基因重组质粒ＤＮＡ的浓度为１２０μｇ／ｍＬ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93