一种修饰的β-分泌酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种修饰的β-分泌酶及其应用，所述β-分泌酶为BACE1，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了修饰的BACE1被修饰位点为SEQ?ID?NO.2所述氨基酸序列的第203位赖氨酸和/或第382位赖氨酸，提供了对所述赖氨酸进行缺失、取代或添加修饰的BACE1及编码所述修饰的BACE1的基因、包含所述基因的载体以及包含所述载体的宿主细胞，还提供了获得所述赖氨酸位点和修饰的BACE1的方法，所述修饰的BACE1可用作影响APP加工处理，特异性调控Aβ形成的药物、筛选BACE1抑制剂以及制备或筛选治疗AD的药物，可实现实验室、临床及工业化应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种修饰的β -分泌酶(β -secretase，又称β -site amyloid cleavage enzyme, BACE)及其应用，具体地说，涉及到利用分子生物学技术得到β -分泌酶 1 (BACEl)中与泛素蛋白酶特异性结合的两个赖氨酸位点，并对所述赖氨酸位点进行修饰得到修饰的BACEl氨基酸序列，以及所述氨基酸序列相应的基因序列，还涉及所述修饰的 BACEl的应用，属于生物

技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)又称为老年性痴呆症，是以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的原发性中枢神经系统退行性疾病，主要发生于老年前期和老年期，目前全世界有3500多万名患者。AD的病理特征之一是β-淀粉样蛋白(Αβ)聚积在大脑皮层中细胞外形成老年斑，Αβ是由β-淀粉样前体蛋白(APP)经过BACE和γ-分泌酶的两步水解而成。然而，在正常的大脑中Αβ形成极少，在正常生理条件下大部分APP 首先在Αβ结构域内被α-分泌酶切割，而不被BACE切割，最终没有A β产生。在某些病理条件下(如APP基因发生突变等)，APP易被BACE作用，于APP氨基端596 597位肽键裂解，产生一个N端大片段(sAPPii)和一个包含有A β完整序列的跨膜片段C99;C99再在Y-分泌酶的作用下裂解产生完整的Aβ分子和APP胞内片段。Αβ在大脑中的纤维化进程和蓄积是AD病理的始发因素，APP在BACE酶切位点被水解是产生A β的必需前提，因此，BACE在A β形成乃至整个AD发病机理中起关键作用，人们一直研究如何使用分泌酶抑制剂特异性的阻止A β形成，作为治疗AD的方法和药物，但是到目前为止，尚未发现可作为筛选分泌酶抑制剂的有效靶点。BACE具有BACEl和BACE2两个同源体。BACEl是一个具有501个氨基酸残基并与天冬氨酸蛋白酶相关的I型膜蛋白，它主要水解切割APP的β位点产生C99片段，进而产生A β，是水解APP生成A β产物的关键酶。BACEl广泛存在于人体内各种组织细胞的高尔基体和内含体中，但在神经细胞中活性最强。BACEl最初是作为未成熟的蛋白前体(分子量约为60KD)在内质网中合成，然后经过一系列加工和修饰快速成熟，成熟的BACEl非常稳定，在培养细胞中的半衰期是9h。 BACEl基因的表达具有组织特异性，在海马、大脑皮层、小脑颗粒神经元和胰岛中表达量最高。BACEl是淀粉样蛋白级联反应中的限速酶，也是产生Αβ过程中的关键调节对象和治疗 AD的潜在靶点。BACEl的降解通过两条途径进行泛素-泛素蛋白酶体途径 (Ubiquitin-Proteason^pathway)禾口溶醇体(lysosomal)途径。其中 BACEl 的泛素一泛素蛋白酶体途径与AD发病机制和大脑的正常老化有关。已有研究证明BACEl的降解和APP 的加工处理是由泛素-泛素蛋白酶体途径调控。
技术实现思路
3针对现有技术中尚未发现可作为筛选分泌酶抑制剂的有效靶点的缺陷，本专利技术的目的之一是提供BACEl与泛素蛋白酶特异性结合的两个关键赖氨酸位点并提供修饰的 BACE1，所述修饰为对所述赖氨酸位点进行缺失、取代或添加。本专利技术的目的之二是提供一种编码所述修饰的BACEl的基因。本专利技术的目的之三是提供一种包含编码所述修饰的BACEl基因的载体。本专利技术的目的之四是提供一种包含所述载体的宿主细胞，所述载体为包含编码所述修饰的BACEl基因的载体。本专利技术的目的之五是提供一种筛选所述赖氨酸位点及制备所述修饰的BACEl的方法。本专利技术的目的之六是提供所述修饰的BACEl的应用。为实现本专利技术的目的，提供技术方案如下。BACEl的基因序列为已知序列，所述基因序列为核苷酸和氨基酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符1所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中的SEQ ID No. 1。与所述BACEl的基因序列对应的氨基酸序列为已知序列，所述氨基酸序列为核苷酸和氨基酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符2所述的氨基酸序列，即核苷酸和氨基酸序列表中的SEQ ID No. 2。一种修饰的BACEl，被修饰的位点为SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列的第203位赖氨酸(Lys203)或/和第382位赖氨酸(Lys382)，所述位点为BACEl与泛素蛋白酶特异性结合的两个关键赖氨酸位点。一种修饰的BACEl，所述修饰为Lys203的缺失、取代或添加。一种修饰的BACEl，所述修饰为Lys382的缺失、取代或添加。一种修饰的BACEl，所述修饰为Lys203和Lys382的缺失、取代或添加。一种编码修饰的BACEl的基因，所述修饰为Lys203的缺失、取代或添加。一种编码修饰的BACEl的基因，所述修饰为Lys382的缺失、取代或添加。一种编码修饰的BACEl的基因，所述修饰为Lys203和Lys382的缺失、取代或添加。一种包含所述编码修饰的BACEl的基因的载体，所述修饰为Lys203的缺失、取代或添力口。一种包含所述编码修饰的BACEl的基因的载体，所述修饰为Lys382的缺失、取代或添力口。一种包含所述编码修饰的BACEl的基因的载体，所述修饰为Lys203和Lys382的缺失、取代或添加。一种包含载体的宿主细胞，所述载体为一种包含所述编码修饰的BACEl的基因的载体，所述修饰为Lys203的缺失、取代或添加。一种包含载体的宿主细胞，所述载体为一种包含所述编码修饰的BACEl的基因的载体，所述修饰为Lys382的缺失、取代或添加。—种包含载体的宿主细胞，所述载体为一种包含所述编码修饰的BACEl的基因的载体，所述修饰为Lys203和Lys382的缺失、取代或添加。一种筛选修饰的BACEl的被修饰位点及制备所述修饰的BACEl的方法所述被修饰的位点为BACEl如SEQ ID NO. 1所述氨基酸序列中Lys203或/和Lys382，所述位点为 BACEl与泛素蛋白酶特异性结合的两个关键赖氨酸位点。所述方法中所涉及的技术手段均为生物
中相应的通用技术手段，具体步骤如下(1)将BACEl的氨基酸序列分段，每个片段中含有1 3个赖氨酸，构建所述个段片段相应的cDNA，并将所述cDNA分别转入质粒，得到含cDNA的质粒；(2)培养细胞，并将所述含cDNA的质粒和含有泛素的质粒共转染进入所述培养的细胞进行蛋白表达；(3)用免疫印迹、免疫沉淀和蛋白印迹方法分析所述表达的蛋白，检测所述细胞中 BACEl片段的蛋白水平，以及BACEl片段与泛素蛋白酶之间共定位的情况；(4)用流式细胞仪检测所述细胞中泛素化的BACEl片段，分析泛素蛋白酶抑制剂对所述细胞中泛素化的BACEl片段降解的影响；(5)通过步骤(3)和⑷分析得到与泛素蛋白酶结合的BACEl片段，对与泛素蛋白酶结合的BACEl片段进行定点基因位点突变，筛选并验证所述BACEl片段中与泛素蛋白酶特异性结合的关键赖氨酸位点；(6)对步骤( 得到的关键赖氨酸位点的基因进行定点基因位点缺失，翻译得到修饰的BACEl，验证所述关键赖氨酸位点对BACEl泛素化的影响。一种本专利技术所述修饰的BACEl在体外细胞模型或体内转基因动物中作为影本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种修饰的ＢＡＣＥ１，其特征在于：修饰前ＢＡＣＥ１的基因为核苷酸和氨基酸序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１，修饰前ＢＡＣＥ１的氨基酸序列为核苷酸和氨基酸序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２，被修饰的位点为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所示氨基酸序列的第２０３位赖氨酸或／和第３８２位赖氨酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：庆宏，冉媛媛，王茸，英郑新，赵娟，邓玉林，张彦彦，王冉，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：11