一种促进樟芝活性产物Antrodin C生物合成的发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种促进樟芝活性产物Antrodin?C生物合成的发酵方法包括：斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中深层液态发酵采用两阶段控制，第一阶段控制溶氧在20％以上，第二阶段控制溶氧在6-15％，发酵温度为18℃-28℃；此外，还可采用溶氧与pH相协同的发酵方法，通过两阶段pH及溶氧混合控制，能显著促进樟芝活性产物Antrodin?C的合成，最高含量达271.8mg/L。本发明专利技术所提供控制技术工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时对樟芝其他活性代谢产物的生产具有一定的启迪意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及,尤其是一种通过两阶段溶氧或溶氧与pH相结合的策略提高活性产物Antrodin C生物合成的方法。技术背景樟芝(Antrodia camphorata)属于多孔菌科、薄孔菌属，是我国台湾特有的珍稀药用真菌。长期以来，樟芝被用作解酒保肝的传统药，用于治疗肝脏疾病，食物和药物所引起的中毒症状以及腹泻，腹痛，高血压，皮肤发庠和肿瘤疾病等。大量文献研究表明，樟芝具有保肝、保护神经系统、抗高血压高血脂、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤、调节免疫等生物活性。由于樟芝的寄主专一性特别强，而其唯一寄主牛樟树非常稀少且生长缓慢，樟芝野生子实体非常难得，而椴木栽培法生长周期长，产量低，难以弥补市场的巨大需求。因此，发酵法生产樟芝活性产物将是一种有效地方法。目前通过樟芝细胞深层液态发酵已较成功的实现了樟芝菌体快速人工培养。现代研究表明，樟芝液态发酵产物在治疗各种肝病方面具有较好的功效。Nakamura (NAKAMURA N, HIRAKAffA A, SHEU C C，et al. Five NewMaleic and Succinic Acid Derivatives from the Mycelium of Antrodia camphorataand Their Cytotoxic Effects on LLC Tumor Cell Line. Journal of Natureproduct,67 46-48.)等人从樟芝液态发酵菌体中分离得到五种新的马来酸和琥珀酸衍生物(Antrodin A-E)，是液态发酵樟芝菌体中的主要活性成分，具有显著的抗肝炎活性，其中Antrodin B和Antrodin C对LLC癌症细胞具有良好的抑制效果。Phuong(PHU0NGT, MA C M, HATTORI M, et al.1nhibitory effects of antrodins A-E from Antrodiacamphorata and their metabolites on hepatitis C virus protease. PhytotherRes, 2009, 23 (4) :582_584.)研究结果显示樟芝菌丝体中含有的Antrodin A-E对HCV病毒都具有很好的抑制活性，其中Antrodin A抑制能力最高；研究同时发现在体内AntrodinC可以转化为Antrodin A，从 而展现良好的保肝活性。Lee(Lee TH，Lee CK, Tsou WL,et al. A New Cytotoxic Agent from Solid-state Fermented Mycelium of Antrodiacamphorata. Planta Letter，2007.)等人用正己焼萃取樟芝固态发酵粉末，得到一个新化合物(Antroquinonol)，属于泛醌类化合物，实验表明对乳腺癌、肝癌和前列腺癌等多种癌细胞具有良好的抗癌效果，同时具有抑制HBsAg和HBeAg合成的潜力，从而抑制HBV的复制。Shu(SHU C H,LUNG M Y. Effect of pH on the production and molecular weightdistribution of exopolysaccharide by Antrodia camphorata in batch cultures.Process Biochemistry，2004，39 :931-937.)等人报道了两阶段pH控制对樟芝液态发酵的影响，但该方法只报道了胞外多糖的生产情况，所公开的最大胞外多糖产量为148mg/L。Shih(SHIH I L，PAN K，HSIEH C.1nfluence of nutritional components and oxygen supply on the mycelialgrowth and bioactive metabolites production in submerged culture of Antrodiacinnamomea. Process Biochemistry, 2006,41 :1129_1135.)等报道了培养基组成和溶氧对樟芝液态发酵的影响，但是该方法主要研究了对樟芝胞内多糖和胞外多糖合成的影响。同时，上述方法并没有根据樟芝细胞生长和产外核层所需要的环境条件(如PH和溶氧)的差异性，采用相应的组合控制策略分别促进樟芝细胞生长和产物合成。公开号为CN1456661A (专利技术名称樟芝大规模液体深层发酵生产工艺)、CN101803528A(—种樟芝菌丝体的新颖培养方法)等专利文献公开了一系列的通过发酵法生产樟芝的细胞培养方法，但上述文献中所公开的细胞培养产物均为樟芝菌丝体或是多糖，并没有关于樟芝菌丝体特征活性产物Antrodin (A-E)类化合物的生产方法报道，也没有关于诱导产生Antroquinonol类化合物的调控方法报道。由于富含生理活性物质的樟芝产品的需求与日俱增，急需一种特殊的大规模人工培养樟芝的方法，该方法可以有针对性地提高樟芝特征活性产物Antrodins和Antroquinonol类化合物的含量，以提高樟芝产品品质，满足市场的不断更新发展。而根据我们查新报告表明，目前并没有关于樟芝特征活性产物Antrodins和Antroquinonol的培养方法及过程优化的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，以显著提高樟芝特征活性产物Antrodin C的产量。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案包括斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中深层液态发酵采用两阶段控制，第一阶段控制溶氧在20%以上，第二阶段控制溶氧在6-15%，发酵温度为18°C -28°C。所述第一阶段的培养时间为0-5天。 为更好的解决技术问题，还可将溶氧两阶段控制策略与pH两阶段控制相结合，第一阶段PH值控制为3. 0-4. 5，第二阶段pH值控制为4. 5-7. 0，优选为4. 5-6. O。本专利技术中，所述的樟芝斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养可以是已知的任何一种适合樟芝生长的培养基和培养条件，液体深层发酵所用到的培养基组成成分也是适合樟芝培养的培养基。作为参考所述的斜面培养基是PDA (potato dextrose agar):樟芝斜面菌种培养条件是培养温度28°C，培养时间为12天。所述的一级液体种子培养基为(g/L):葡萄糖20，Na2HPO4 O. 5，MgSO4O. 5，柠檬酸O. 5，黄豆粉4，玉米浆粉2。一级液体种子培养条件为培养温度28°C，摇床转速100r/min，培养时间4d。所述的二级液体种子培养基为(g/L):葡萄糖20，Na2HPO4 O. 5，MgSO4O. 5，柠檬酸O. 5，黄豆粉4，玉米浆粉2。二级液体种子培养条件为培养温度28°C，摇床转速100r/min。所述的液体深层发酵培养基为(g/L):葡萄糖60，Na2HPO4 O. 5，MgSO4O. 5，黄豆粉8，玉米浆粉2。液体深层发酵温度条件28 °C。所述的樟芝菌株来源于台资企业上海福茂食用菌有限公司。菌种来源可参考本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种促进樟芝活性产物Ａｎｔｒｏｄｉｎ　Ｃ生物合成的发酵方法，其特征在于采用溶氧两阶段控制的液体深层发酵，第一阶段控制溶氧在２０％以上，第二阶段控制溶氧在６－１５％，发酵温度为１８℃－２８℃。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许赣荣，夏永军，喻学淳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32