一种细菌群体感应抑制剂及其筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种细菌群体感应抑制剂及其筛选方法，其特征在于：首先将海藻干燥粉碎后，加入乙醇溶液进行提取，然后将提取液用细菌生物感应器紫色杆菌CV026和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，检测结果为阳性的提取液即为细菌群体感应抑制剂。本发明专利技术的抑制剂筛选方法快速有效，可以高效的从海洋藻类中筛选出细菌群体感应抑制剂。本发明专利技术筛选出的细菌群体感应抑制剂可应用于新鲜食品或制品的防腐保鲜，相比于现有的化学合成抑制剂天然无毒害，保鲜效果更好。本发明专利技术筛选方法适合工业化生产，制备的抑制剂的产量能够很好的满足实际应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品保鲜
，具体涉及。
技术介绍
细菌的“群体感应”(Quorum knsing，简称QS)即依赖于细菌的数量(Quorum)达到一定密度时才能发生的感应现象(knsing)。当一个特定环境中的细菌数量增加时，会激活细菌靶基因的表达，展现出新的行为特征，如生物发光、质粒转移、毒性因子的产生、孢子的萌发和生物膜的形成等。食品的腐败过程是受腐败菌QS系统调控的，以群体感应信号分子为新靶点调控食品腐败的过程为食品贮藏保鲜提供了一种新策略。通过干扰信号分子与受体蛋白结合而影响QS体系是群体感应抑制剂(QSI)研究的主要方向，而抑制剂的来源主要包括人工合成和天然存在的小分子化合物。从食品安全的角度考虑，近年来，天然群体感应抑制剂备受关注。关于群体感应的专利主要集中于群体感应的检测方法与群体感应的基因调控方面，其中专利(一种检测革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的方法，200910025868. 6)报道了群体感应抑制剂的检测方法，主要检测微生物来源的群体感应抑制剂。但微生物来源的群体感应抑制剂在食品中的应用具有局限性，微生物代谢产物复杂，往往产生有害代谢产物，对食品产生污染或引起食物中毒。因此，急需获得一种能在食品领域中应用的细菌群体感应抑制剂，以填充我国关于海藻细菌群体感应抑制剂的空白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，以克服现有技术的不足。本专利技术是从取之不尽的理想原料的海洋藻类中分离制备细菌群体感应抑制剂，其产品具有天然、安全的特点，且我国海藻资源丰富，更利于本专利技术产品的工业化生产。本专利技术的细菌群体感应抑制剂，是对细菌生物感应器紫色杆菌CV(^6和己酰基高丝氨酸内酯检测为阳性的海藻乙醇提取物。本专利技术的细菌群体感应抑制剂的筛选方法如下首先将海藻干燥粉碎后，加入乙醇溶液进行提取，提取液用细菌生物感应器紫色杆菌CV(^6和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，检测为阳性的提取液为本专利技术的细菌群体感应抑制剂。上述的检测方法可以用如下的方法替代将野生菌株ChromcAacterium violaceum ATCC 31532的mini_Tn5突变体紫色杆菌CV(^6过夜活化两次后，按2%比例接种于含有20 μ g/mL卡那霉素的新鲜LB肉汤中，150r/min振荡培养16-1 后，与IOOmL含有10 μ mol/L酰化高丝氨酸内酯C6-HSL、0. 8g/100mL琼脂的LB培养基混合，倒平板，待凝固后用直径为6mm的打孔器打孔，将上述海藻提取液加入培养基孔中，将平板置于27-30°C 的恒温培养箱中过夜培养Mh，观察现象即可判断海藻提取液是否细菌群体感应抑制剂，如果添加了海藻提取液的孔周围是紫色，即检测结果为阴性，如果添加了海藻提取液的孔周围紫色变浅或褪去，则检测结果为阳性，该海藻提取液为细菌群体感应抑制剂。所述的海洋藻类为绿藻、褐藻、红藻等。检测的阳性细菌群体感应抑制剂为为钝顶螺旋藻、裂叶马尾藻或裙带菜的提取液。本专利技术的抑制剂筛选方法快速有效，可以高效的从海洋藻类中筛选出细菌群体感应抑制剂。本专利技术筛选出的细菌群体感应抑制剂可应用于新鲜食品或制品的防腐保鲜，相比于现有的化学合成抑制剂天然无毒害，保鲜效果更好。本专利技术的筛选方法适合工业化生产，制备的抑制剂产量能够很好的满足实际应用。具体实施例方式本专利技术的筛选方法首先将海藻冷冻干燥后磨碎过筛，取海藻干粉，按1 10(g/ mL)的料液比用75% -85%乙醇超声提取30min，离心除残渣，滤液经旋转蒸发仪蒸干乙醇得海藻粗提液，粗提液再先后用石油醚、乙酸乙酯萃取取水相即得海藻提取液，该提取液经 0. 22 μ m滤膜过滤除菌，再用细菌生物感应器紫色杆菌CV(^6和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，检测为阳性的提取液为本专利技术的细菌群体感应抑制剂。上述的细菌生物感应器紫色杆菌CV(^6和己酰基高丝氨酸内酯进行检测参照中国专利技术专利一种检测革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的方法，申请号200910025868. 6来进行。上述检测方法还可以用如下的方法替代将菌株紫色杆菌CV(^6过夜活化两次后，按2%比例接种于含有20 μ g/mL卡那霉素的新鲜LB肉汤中，150r/min振荡培养16-1 后，与IOOmL含有10 μ mol/L酰化高丝氨酸内酯C6-HSL、0. 8g/100mL琼脂的LB培养基混合， 倒平板，待凝固后用直径为6mm的打孔器打孔，将上述海藻提取液加入培养基孔中，将平板置于27-30°C的恒温培养箱中过夜培养Mh，观察现象即可判断海藻提取液是否细菌群体感应抑制剂，如果添加了海藻提取液的培养基孔周围是紫色，即检测结果为阴性，如果添加了海藻提取液的培养基孔周围紫色变浅或褪去，则检测结果为阳性，表明该海藻提取液为细菌群体感应抑制剂。其中菌株紫色杆菌CV026 为野生菌株 Chromobacte rium violaceum ATCC31532 的mini-Tn5突变体，也记载在申请号为200910025868. 6的专利技术专利中。下面结合实施例对本专利技术的筛选方法进行详细描述实施例1钝顶螺旋藻经冷冻干燥，粉碎，过40目筛，取IOOg粉末，加入75%乙醇IOOOmL,超声提取30min，过滤除去残渣，残渣重复提取两次，合并三次滤液经旋转蒸发仪蒸干(真空度0. lkPa，温度30°C )，提取物浓缩(13. 25g)，添加同体积石油醚与蒸馏水萃取，弃去石油醚相，水相再用乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯，水相用旋转蒸发仪蒸干，用蒸馏水配成质量体积浓度为0. 125 %-1%的海藻提取液，该提取液经0. 22 μ m滤膜过滤除菌，通过细菌生物感应器紫色杆菌CV(^6和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，此提取液检测结果为阳性，确定为细菌群体感应抑制剂-钝顶螺旋藻抑制剂。为了验证本专利技术方法的有效性，将新鲜虾放入浓度为0. 125% -1%的本实施例的抑制剂水溶液中浸泡后取出保藏作为实验组，共3个平行；同时将同一批的鲜虾用没有加入抑制剂的蒸馏水浸泡作为对照组，也是3个平行；将对照组和实验组都放在同一冰温下保藏，测保质期。结果显示，对照组的虾保质期仅为4天，而浸泡组提取液的虾保质期得到延长，在6天后还具有很好的新鲜度。同时，液相色谱检测显示实验组的虾中并没有化学合成的抑制剂所产生的有害化学物质，能够满足食品安全的要求。实施例2裂叶马尾藻经冷冻干燥，粉碎，过40目筛，取IOOg粉末，加入80%乙醇IOOOmL, 超声提取30min，过滤除去残渣，残渣重复提取两次，合并三次滤液经旋转蒸发仪蒸干，提取物浓缩(3. 82g)，先后用石油醚、乙酸乙酯萃取，取水相，水相用旋转蒸发仪蒸干，用蒸馏水配成质量体积浓度为0. lg/mL-lg/mL的海藻提取液，除菌后通过细菌生物感应器紫色杆菌 CV026和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，此提取液检测结果为阳性，确定为细菌群体感应抑制剂-裂叶马尾藻抑制剂。为了验证本专利技术方法的有效性，将新鲜虾放入浓度为0. lg/mL-lg/mL的本实施例的抑制剂水溶液中浸泡后取出保藏作为实验组，共3个平行；同时将同一批的鲜虾用没有加入抑制剂的蒸馏水浸泡作为对照组，也是3个平行；将对照组和实验组都放在同一冰温下保藏，测保质期。结果显示，对照组的虾保质期仅为4天，而浸泡组提取液的虾保质期得本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种细菌群体感应抑制剂，是对细菌生物感应器紫色杆菌ＣＶ０２６和己酰基高丝氨酸内酯检测为阳性的海藻乙醇提取物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾名湧，曾惠，朱素芹，刘尊英，董士远，赵元晖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95