本发明专利技术通过调整水稻幼苗的生长条件，缩短了水稻的培养时间，同时采用酶法制备得到水稻绿色原生质体，并优化了制备方法，避免了抽真空和使用剧毒试剂，使水稻绿色原生质体的制备方法更为简单和安全。本发明专利技术方法制得的原生质体细胞存活率高，转化效率高，适用于目的基因编码蛋白的亚细胞定位、蛋白相互作用和蛋白免疫印迹等多种分析，特别适用于光/叶绿体相关基因的瞬时表达研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种原生质体的制备方法，特别涉及一种水稻绿色原生质体的制备方法。本专利技术还涉及制得的水稻绿色原生质体在光/叶绿体相关基因瞬时表达研究中的应用。
技术介绍
水稻是重要的粮食作物与模式生物之一，随着基因组序列的破译，对其基因功能进行鉴定具有重要意义。植物瞬时表达基因方法由于其快速、高效，被广泛应用于基因功能鉴定和高通量分析基因功能上。利用原生质体瞬时基因表达系统，可以快速鉴定水稻基因的功能，可以为细胞学、生理学和遗传学建立试验体系，因而高效快捷地进行水稻原生质体制备是开展上述工作的基础和关键。目前，如 Davey MR, Anthony P: Plant Cell Culture: Essential Methods. 2001、Hayashimoto A, Li Z, Murai N: A polyethylene glycol—mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol 1990，93 (3) :857-863 及 Bart R, Chern M, Park C-J, Bartley L, Ronald P: A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods 2006, 2 (1) : 13等文章所述，水稻原生质体主要来源于水稻胚性细胞、悬浮细胞系和黄化苗。然而胚性细胞、悬浮细胞系和黄化苗的细胞均处于非正常状态，没有形成正常的叶绿体，不是一个正常生理状态的细胞体系，因而不适用于很多研究，尤其是与叶绿体和光合作用相关的研究。基于此，研究者们分别探索用水稻绿苗去制备绿色原生质体，Bart Rj Chern Mj Park C-Jj Bartley Lj Ronald P: A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods 2006， 2(1) : 13禾口Chen S，Tao L，Zeng L，Vega-Sanchez ME, Umemura K，Wang GL: A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol 2006，7 (5) : 417-427 两篇文章分别使用2周龄和2月龄的水稻植株，并且在方法中使用抽真空、加入抗生素、使用有强烈毒性的巯基乙醇等步骤分离绿色原生质体，然而所分离到的绿色原生质体的转化效率很低，不如来自黄化苗的原生质体效率高。并且，仅仅做了植物抗性基因表达分析和siRNA 介导的基因沉默研究方面的应用。通过现有技术制备得到的水稻绿色原生质体，转染率普遍不高，难以满足基因瞬时表达的需要。如Bart R, Chern M, Park C-J, Bartley L, Ronald P: A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods 2006, 2 (1) : 13 禾口 Chen S, Tao L, Zeng L, Vega-Sanchez ME, Umemura K, Wang GL: A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Patkol2006, 7(5) :417-427所指出的，分离得到的水稻绿色原生质体的转化效率低于黄化苗原生质体，而已有报导的水稻黄化苗原生质的转化效率最高也只能达到70%。同时，现有方法制备得到的水稻绿色原生质体，对小质粒的转化效率高，而对大于12 kb的质粒，转化效率很低，只能达到25% 30%，这也限制了大片段基因的研究。为更好地进行与水稻光合作用相关功能基因表达的研究，需要提供一种高效率、 简便、快速和低成本的水稻绿色原生质体基因表达系统。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的水稻绿色原生质体的制备方法。本专利技术的另一个目的在于提供按本专利技术方法制备得到的原生质体在光/叶绿体相关基因瞬时表达研究中的应用。本专利技术所采取的技术方案是水稻绿色原生质体的制备方法，包括以下步骤1)将水稻种子的颖壳剥去，清洁消毒；2)将种子播种在灭菌培养基上，无菌培养，在培养期间给予光照，以获得绿色的水稻幼苗；3)取水稻幼苗的茎组织，切成小段投入渗透压调节液，置于暗处调节渗透压；4)将处理得到的茎组织洗净，加入酶解液，暗处振荡酶解，使茎组织中的细胞游离；5)加入W5溶液，振荡洗脱，过滤收集游离细胞，即得原生质体。优选的，培养基为1/2 MS培养基。种子培养的条件为26 °C，光照12 h，黑暗处理12 h，光照的强度为8000 Lux。种子培养的时间为7 10天。优选的，渗透压调节液为0. 6 M的无菌甘露醇溶液，处理时间为9 11 min。优选的，每10 ml的酶解液中含有MOO U纤维素酶RS、225 U离析酶R-10，其中， 甘露醇的浓度为0.5 M,MES的浓度为10 mM，pH为5. 7，55 °C温育10 min使其中的DNA酶和蛋白酶失活，冷却后加入10 mM CaCl2和0. 1% BSA，过滤灭菌。优选的，酶解液的酶解时间为4 5 h。本专利技术的有益效果是使用本专利技术方法简单、高效，可以低成本地获得大量水稻绿色原生质体。制备得到的水稻绿色原生质体细胞生长状态良好、活力高，是含有叶绿体的、有光合活性的绿色原生质体，是更正常的、更接近生理水平的细胞体系。制备得到的水稻绿色原生质体细胞，易于转染适合于叶绿体、光合作用相关的研究目的。使用1/2 MS培养基，保证水稻种子可以很好地萌发，得到的茎组织具有很好的活性。本专利技术通过精心选择培养时间，调整培养参数，使获得的水稻绿色原生质体具有很好的细胞活力与光合活性，保证其可用于光/叶绿体相关基因的瞬时表达研究。使用0. 6 M的无菌甘露醇溶液处理水稻的茎组织9 11 min,有效的保证了细胞的活性，同时，使得茎组织分散均勻，不易聚集。通过精心调配酶解液，可以更好地将细胞壁去除，使细胞游离出来；同时，省去了抽真空步骤，不损伤细胞的活性，保证了原生质体的高活性和高产量。同时，避免使用抗生素以及剧毒的巯基乙醇，大大提高操作的安全和方便性。附图说明 图1是本专利技术方法制得的原生质体的二乙酸荧光素染色图； 图2是pUC-GF本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．水稻绿色原生质体的制备方法，包括以下步骤：１）将水稻种子的颖壳剥去，清洁消毒；２）将种子播种在灭菌培养基上，无菌培养，在培养期间给予光照，以获得绿色的水稻幼苗；３）取水稻幼苗的茎组织，切成小段投入渗透压调节液，置于暗处调节渗透压；４）将处理得到的茎组织洗净，加入酶解液，暗处振荡酶解，使茎组织中的细胞游离；５）加入Ｗ５溶液，振荡洗脱，过滤收集游离细胞，即得原生质体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王宏斌，张洋，苏建斌，王金发，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81
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