本发明专利技术公开了一种多癌风险易感性突变位点及其应用和制备的试剂盒。本发明专利技术通过研究证实，多癌家系染色体3q24-26区域与疾病位点紧密连锁，基因突变筛查进一步证实人TSC22D2基因的ATG上游-91bp?T＞C突变(c.-91T＞C)在多癌家系中与致病单体型共分离，通过在当地正常人群大规模测序验证，该突变为阴性。从而提出针对该突变位点的基因型可用于肿瘤遗传易感人群的筛查，用于肿瘤患病风险预测。并研制了相关的突变筛查试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、高通量等优点，与传统的测序方法相比，无需PCR产物的纯化，减少了交差污染等人为因素的干扰，同时节省了大量的人力、财力和物力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属肿瘤分子遗传学领域，涉及一种多癌风险易感性突变位点及其应用和制备的试剂盒。
技术介绍
肿瘤是一种多基因复杂性疾病，其发生是环境因素与肿瘤遗传易感因素共同作用的结果。基因突变是导致不同个体对肿瘤遗传易感存在差异的重要原因。瘤基因与抑瘤基因的突变、线粒体DNA突变以及不稳定性三核苷酸重复序列的动态突变等均与肿瘤的遗传易感性相关。如果瘤基因与抑瘤基因的突变，存在家族与人群聚集性，可显著提高患肿瘤的风险，那么对于这些突变位点在健康或肿瘤人群中进行筛查，无疑能对具有肿瘤遗传易感倾向的人群起到的风险预警和早期诊断的作用。传统的突变检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。 这些技术虽在某种程度上能完成对突变位点的检测，但由于它们必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的检测目标还相差甚远。传统的RFLP只能检测到突变的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，而且DNA链的二级结构还容易造成人工假相，使测序结果出现偏差，不适宜于突变的检测；SSCP则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具，但如果涉及的突变位点不多时，用高通量DNA芯片则因成本较高也不适且。才目比之下，变个生高效液才目色i普(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)在突变检测上具有较大的优势。DHPLC是一种在SSCP和DGGE基础上发展起来的新的高通量筛选DNA序列变异的技术，其原理是通过HPLC在部分变性的条件下将发生错配的异源杂合双链DNA与完全匹配的同源双链DNA分离开来。该技术可以自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失，还可分离分析大小相近而序列存在差异的DNA，是一种高性价比的检测技术。与传统的杂合双链分析技术相比较，上样前PCR 产物不需要酶切、纯化，可直接进行分析，同时过柱不需要灌胶、上样、电泳等繁琐的跑胶过程，该技术花时短，分析一个样品一般仅需5分钟，不需使用放射性同位素，自动化程度高， 大大降低了交叉污染的几率、减少了工作量和成本。因此具有高通量、自动化、快速、检出率高、重复性好、检测DNA片段大小范围广等优点。运用DHPLC技术的WAVE核苷酸片段分析系统可以快速、自动化地进行分析。目前国内外，DHPLC技术已在基因分型分析、肿瘤的突变检测、地中海贫血的基因诊断等方面得到了广泛的应用。当前DHPLC仪器和技术已经在各地市级医院非常普及，也是该试剂盒得以推广的重要保证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过研究与多种肿瘤发生相关的突变，从而提供一种多癌风险易感性突变位点及其应用和制备的试剂盒。可用于正常人群肿瘤遗传易感性的筛查，起到风险预警、早期诊断的作用。一种多癌风险易感性突变位点，位于人TSC22D2基因的ATG上游_91bp，T > C，其基因型包括阴性基因型tt和多癌易感风险基因型tc或CC。—种多癌风险易感性突变位点应用于制备检测多癌风险易感性试剂，所述的多癌风险易感性突变位点位于人TSC22D2基因的ATG上游_91bp，T > C，其基因型包括阴性基因型tt和多癌易感风险基因型tc或cc。所述的试剂包括DNA测序试剂、限制性酶切片段长度多态性试剂、单链构象多态性试剂、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交试剂或变性高效液相色谱试剂。最适合为变性高效液相色谱试剂。所述试剂中含有针对突变位点设计的引物序列L 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3‘R 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3‘。一种检测多癌风险易感性的突变筛查试剂盒，包括DNA抽提试剂，PCR试剂和 DHPLC检测用试剂，在PCR试剂中包含针对人TSC22D2基因ATG上游_91bp，T > C突变位点设计的上下游引物，L :5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3‘ ；R 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3‘； 在DHPLC检测用试剂中，包括所述突变位点基因型为tt的阴性基因组DNA。专利技术人通过对湖南罕见多癌家系的研究证实TSC22D2基因(Homo sapiens TSC22 domain family,member 2，基因存取号NM_014779. 2，基因存取号来源为NCBI数据库)调控区存在c. -91T > C突变位点在家系中与致病单体型共分离。TSC22D2基因属于TSC22结构域家族，其基因家族成员还有TSC22D1、TSC22D3、TSC22D4。目前对TSC22D1的研究提示，该基因家族可能参与TGF β信号通路，该通路与肿瘤的抑制密切相关。在多种肿瘤中TSC22D1 的mRNA表达下调，也表明其与恶性细胞增生有关。因此我们推测，TSC22D2作为基因家族成员之一，可能由于具有相同的结构域而具有相同或类似的功能。通过对当地500例正常人群进行该位点的突变筛查，其结果均为阴性。上述遗传学证据都提示，该基因及其突变可能与多种肿瘤的疾病发生相关，针对该位点进行人群中的基因分型可以起到患癌风险预测的作用。考虑到人群中大量样本为阴性，本专利技术的专利技术人在传统DHPLC方法上进行改进， 不是将单纯样本PCR产物上DHPLC仪进行检测，而是采取将待测样本PCR产物与阴性对照的样本DNA等量混合，变性后上DHPLC检测。这样DNA双链经变性后打开，如果有突变的话， 缓慢复性后重新结合的双链中就会出现异源链，从而在DHPLC图中出现双峰。混合法可以减少的DHPLC次数并提高一次DHPLC的判别效能。可以只用一次DHPLC就区分风险易感人群和正常人群。为适应DHPLC方法快速检测该突变，本专利技术提供一种用于检测人类多癌风险易感风险性的诊断试剂盒。该试剂盒包括常规DNA抽提试剂，PCR试剂和DHPLC检测用试剂。在 PCR试剂中包括常规PCR试剂，如高保真Taq酶、MgCl2+缓冲液、PCR专用去离子水等之外， 还包括待测突变位点c. -91Τ > C的上下游PCR引物，引物分别针对突变位点上游300bp和下游300bp各600bp范围的片段而设计，产物大小在200 300bp之间。在DHPLC检测用试剂中，除包含常规HPLC试剂外，还包括所述突变位点的阴性对照基因组DNA。所述引物具体核苷酸序列如下LEFT PRIMER 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3‘RIGHT PRIMER 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3'本专利技术试剂盒的使用方法为(1)用枸橼酸钠抗凝管收集待测个体外周血样本， 抽提基因组DNA (大于50ng/样本)；( 用本专利技术试剂盒进行PCR扩增，得到产物特异目的条带；( 取PCR产物与阴性纯合子DNA等量混合，用变性高效液相色谱系统进行检测，区分多癌风险易感阴性和阳性结果。本专利技术的优点为本专利技术首次发现位于人类染色体3q25. 1的TSC22D2基因ATG上游-91bp存在突变T > C(c. -91T > C)，该突本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多癌风险易感性突变位点，其特征在于：所述的突变位点位于人ＴＳＣ２２Ｄ２基因的ＡＴＧ上游－９１ｂｐ，Ｔ＞Ｃ，其基因型包括阴性基因型ｔｔ和多癌易感风险基因型ｔｃ或ｃｃ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李桂源，肖岚，熊炜，曾朝阳，谭世明，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：43
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