本发明专利技术公开了一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂，所述生物标记物试剂为人UHRF1基因。本发明专利技术所述生物标记物试剂UHRF1基因与乳腺癌的远处转移能力密切相关，利用UHRF1基因作为预测乳腺癌远处转移能力的生物标志物，与目前常规的病理分型判断乳腺癌的转移和预后相比，可以更加个体化、准确的预测乳腺癌的恶性程度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂。
技术介绍
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，每年大约有30%以上的患者死于乳腺癌复发和转移，乳腺癌转移是导致乳腺癌治疗失败的主要原因之一，乳腺癌一旦发生转移，即便手术治疗，也将严重影响患者的生存质量，且1/3的乳腺癌患者有复发和转移的危险，导致不良的预后以及高的病死率。乳腺癌的转移是与其本身生物学特性以及宿主环境和基因变化等相关的，是一个多基因参与、多步骤完成的复杂过程，涉及肿瘤细胞自身生长优势的获得，细胞间黏附能力的降低，癌细胞对细胞外间质和基底膜的降解与破坏，细胞骨架重构引起细胞运动与迁移， 细胞因子诱导的癌细胞器官特异性定向归巢，以及肿瘤血管和淋巴管生成，癌细胞逃逸凋亡和免疫杀伤等诸多因素，因此，在分子生物学水平，寻找和分析乳腺癌转移的机制非常重要，了解乳腺癌转移的自然规律，有助于选择治疗乳腺癌的最好方案。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂，所述生物标记物试剂为人UHRFl基因。上述技术方案中，所述乳腺癌状态包括乳腺癌细胞的转移性能与迁移性能。上述技术方案中，当乳腺癌细胞的转移性能或迁移性能增强时，即当乳腺癌细胞的转移能力或迁移能力提高时，所述生物标记物试剂人UHRFl基因的表达量也增加。因此，本专利技术同时要求保护人UHRFl基因作为表征乳腺癌细胞的转移性能或迁移性能的生物标记物试剂的应用。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点1.本专利技术所述生物标记物试剂UHRFl基因与乳腺癌的远处转移能力密切相关，利用 UHRFl基因作为预测乳腺癌远处转移能力的生物标志物，与目前常规的病理分型判断乳腺癌的转移和预后相比，可以更加个体化、准确的预测乳腺癌的恶性程度。附图说明图1.实施例中UHRFl转染后MDA-MB-231细胞UHRFl mRNA (A)和蛋白(B)表达情况；图2.实施例中UHRFl基因促进MDA-MB-231细胞迁移情况图； 图3.实施例中UHRFl基因促进MDA-MB-231细胞浸润情况图； 图4.实施例中UHRFl与PTEN和maspin的相互作用情况图； 图5.实施例中细胞接种后的脏器转移图片。具体实施例方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述 实施例一1. 1 材料人乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MDA-MB-453购于美国细胞收藏中心 (ATCC)，并由本实验室保存和培养；D-MEM培养基干粉，小牛血清，胰酶粉末购自Gibco公司；标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、IOX转膜液、30%Acry-Bis、Tris-Hcl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMS0)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程有限公司；抗UHRFl、cyclin BUcyclin Dl等抗体购自美国Santa Cruzs生物技术公司。RNase A 禾Π 10 μ g/mL proteinase K 购自美国 Sigma Aldrich 公司。1.2 细胞培养MDA-MB-231及MDA-MB-453细胞培养于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素和链霉素的D-EME培养基。细胞置于5%C02，37°C培养箱内培养，每 2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。1.3细胞的转染和克隆筛选转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数，以合适的密度接种6孔板，置于(X)2培养箱中培养过夜，使转染当日细胞融合度为70% 90%。在铺板和转染期间避免使用抗生素。转染溶液配制质粒Lipofectamine2000用量比为1μ g/孔2. 5μ 1/孔。2 μ g/ 孔DNA加入100 μ 1/孔DMEM混勻，室温静置5min，备用；5 μ 1/孔Lipofectamine2000加入 100 μ 1/孔基础DMEM混勻，室温静置5min，备用；按照现有技术构建真核表达质粒PCDNA3-UHRF1，应用脂质体转染的方法，将真核表达质粒pcDNA3-UHRFl分别转染到人类乳腺癌MDA-MB-231细胞，同时转染“空”的pcDNA3质粒作为阳性对照，RT-PCR电泳图见图1A。从图中可以看出，UHRFl基因转染可明显增加 MDA-MB-231/UHRF1细胞中UHRFl mRNA的表达水平，而相应的母细胞和空质粒细胞中未见表达。Western blot电泳图(图1B)的结果显示MDA-MB-231/UHRFl细胞中的UHRFl蛋白表达水平明显高于相应的母细胞和转染“空”质粒的细胞，同时，母细胞和转染“空”质粒的细胞UHRFl蛋白表达水平未见明显差异，上述结果表明，UHRFl基因已经成功转染乳腺癌 MDA-MB-231 细胞。上述脂质体转染的方法具体为将稀释的DNA同稀释的脂质体试剂混合，在室温保温30min后，加入800 μ 1/孔基础DMEM，备用。用PBS及无抗生素的基础DMEM洗涤细胞， 每孔加入Iml转染混合液，5% CO2, 37° C培养5 h。证后，弃去含转染试剂的培养液，加入新鲜的完全培养基，继续培养后，72小时内完成实验即为瞬时转染；如果细胞继续培养4 后，更换含G418的培养基，大约两周后，筛选阳性稳定克隆，即为稳定转染。1. 4细胞感染和克隆筛选293细胞在10%新生牛血清的完全D-MEM中培养。待细胞长至培养到大约70% 80%时，培养基更换为含体积分数为2. 5%新生牛血清的DMEM， 加入重组腺病毒粗提液，继续培养观察48 72小时，收集呈病态反应的293细胞，反复冻融5次，每次冻融后振摇30秒，1 500 rpm离心20分钟，弃细胞碎片，收集上清，经氯化铯密度梯度两次离心浓缩腺病毒颗粒，经Hanks液透析后，加入体积分数为20%甘油，分装后于-70°C冻存备用。病毒滴度采用噬斑分析法结合细胞病变测定法来完成。接种293细胞。取待测病毒液作10倍比稀释，取每一稀释度的病毒液按0. 3ml/平皿(孔)量感染细胞，细胞上铺0. 6% 的琼脂糖凝胶。正常换液直至蚀斑出现。病毒滴度=蚀斑个数X稀释度/0.3%X100%。 Ad5-LacZ 以 MOI 为 5，50，100，200 分别感染 MDA-MB-231 和 MDA-MB-453 细胞，4 小时后用培养液洗涤去除游离病毒，于37°C、0. 05 CO2培养M小时，体积分数为2. 5%戊二醛固定15分钟，再以含10 mmoi r1 MgCl2的生理盐水洗2遍，X_gal染色48小时后计数蓝染细胞。计算蓝色细胞百分率。按将近百分之百(或以上的)肿瘤细胞被感染的强度感染乳腺癌细胞。1.5体外划痕实验采用体外划痕方法测定细胞迁移能力，该方法具体为取对数生长期细胞，按1 X 106/ml接种于6孔培养板，培养至细胞完全饱和，经无血清DMEM同步化24h后，用无菌的Tip头在各培养板细胞生长单层的相同位置，划垂直或平行直线，人为造成几条“伤口”，PBS洗3次，细致地去除被移液管尖破坏而脱落的细胞，拍照(此时作为划痕后0本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测乳腺癌状态的生物标记物试剂，所述生物标记物试剂为人ＵＨＲＦ１基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李新莉，樊赛军，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32
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