一种大分子量T载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种T载体及其制备方法。是以已知载体为出发载体进行改良后的载体，出发载体是pBlueScript?II?SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或pGEM系列载体，它们的多克隆位点被替换为XcmI盒，所述的XcmI盒包括ccdB基因序列以及紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个XcmI酶切位点序列，并且出发载体中的抗性基因前和/或后插入了长度为1000～2000bp的无义序列而被延长。本发明专利技术的T载体具有较高TA克隆效率，尤其对于克隆2500bp至3500bp之间的常规商业克隆载体不易于区分的片段，TA克隆效率可达100％，将在基因工程领域中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及一种大分子量T载体及其制备方法。
技术介绍
PCR(polymerase chain reaction)是分子生物学中的常规实验技术。绝大多数情况下需要将PCR扩增产物克隆到质粒载体上，以便对PCR产物进行测序、体外转录、体外翻译等操作。克隆PCR产物的方法有很多种，但最直接的、最方便的方法是TA克隆。所谓TA 克隆就是将3’端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到3’端具有单个T尾巴的T载体上。TA 克隆的理论依据是在PCR扩增过程中，由于Taq聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3’末端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的脱氧腺苷酸，使得50%以上的PCR产物的3’末端具有单个脱氧腺苷酸，即3’端A尾巴。目前，T载体的制备方法有2种。第一种方法是利用产生平末端的内切酶将环状质粒酶切成线状质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到线状载体的3’端。第二种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3’端具有单个T突出的线性T载体。前一种方法在制备T载体过程中存在加尾效率较低以及线性质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题。与前两种方法相比，第二种方法更快捷、更高效以及更稳定。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括)(CmI，Eamll05I，其中kml在制备T载体中得到广泛应用。其它内切酶要么因为太昂贵，要么因为在普通的克隆载体上有太多的识别位点，因而在制备T载体中的应用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆载体中，例如pUC18、pBlueSCript SK载体等，都不具有kml 酶切位点，但在Amp抗性基因中含有一个Eamll05I及其同裂酶的酶切位点，因而在这些载体的多克隆位点引入)(cml位点更方便一些，这就是为什么更多人采用kml制备T载体(美国专利文献 US005487993A ；中国专利文献 CN1142279C, CN1344795A 以及 CN1362521A)。使用)(cml构建T载体均存在一个潜在的问题部分酶切的前T载体混杂在T载体中会导致非重组转化子的本底过高。目前，解决这一问题最有效的方法是在前T载体的两个kml或两个kml酶切位点之间引入足够长的间隔DNA，经琼脂糖凝胶电泳后将完全酶切的质粒和部分酶切的质粒分开。然而，引入间隔DNA后带来的一个新问题是由于环形质粒在琼脂糖凝胶电泳中比起分子量相当的线型质粒移动得快，因而，未被酶切的环型质粒 (前T载体，带有间隔DNA)往往与分子量小于自身的T载体(不带有间隔DNA)混杂，最终造成非重组转化子的本底过高。pBlueScript II SK(+/-)载体(GenBank Accession No. X52330)是由 pUC载体派生而来的噬菌粒载体(phagemid或phasmid)，除了含有一个Amp抗性基因及一个IacZ基因作为筛选标记外，在多克隆位点的两侧存在T3和T7噬菌体的启动子，同时具有一个单链噬菌体fl的复制起点(pBlu必cript II SK(+)和pBlueScript II SK(-)的唯一区别是两者 Π的方向相反)。ccdB 基因(GenBank Accession No. AP001918)位于 F 质粒上，它和 ccdA 基因一起构成F质粒的ccd (control or cell death)位点。Ccd位点通过杀死不含F质粒的大肠杆菌细胞达到稳定F质粒的作用。CcdB蛋白干扰大肠杆菌的DNA促旋酶，因而抵制大多数大肠杆菌菌株。但是大肠杆菌DB3. 1菌株中促旋酶的A亚基基因发生了一处突变，突变后的促旋酶可以抵抗CcdB蛋白的毒性效应，因而含有ccdB基因的质粒要以在DB3. 1菌株中增殖。目前，市场上常用的T载体长度都在^OObp到3100bp之间，对于长度在2500bp 至3500bp之间的片段而言，通过酶切得到的片段，很难和该类载体在电泳时长度上做出明显的区分，不利于后续更换载体等的后续操作，很容易和载体一起回收，最终造成非重组转化子的本底过高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，针对目前常用的T载体长度都在^OObp到3100bp 之间，对于长度在2500bp至3500bp之间的外源片段的克隆，存在非重组转化子的本底过高，克隆效率较低的不足，而提供一种克隆2500bp至3500bp片段具有较高TA克隆效率的 T载体及其制备方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下本专利技术的第一方面是提供一种前T载体，是以已知载体为出发载体进行改良后的载体，出发载体是 pBlu必cript II SK(-)，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pUC19，或 pGEM 系列载体，它们的多克隆位点被替换为)(cml盒，所述的kml盒包括ccdB基因序列以及紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个kml酶切位点序列，并且出发载体中的抗性基因前和/或后插入了长度为1000 2000bp的无义序列而被延长。较佳的，所述的kml盒还包括连接于所述各一个kml酶切位点序列的除kml酶切位点序列外的酶切位点序列。更佳的，所述的)CcmI盒的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或 SEQ ID NO 6 所示。出发载体中的抗性基因前和/或后插入了长度为1000 2000bp，优选1500bp的无义序列而被延长。所谓的无义序列是指不影响载体复制、转录、翻译等功能的序列，例如可以是某些载体的骨架结构，如包含AMP抗性基因的载体pJETl. 2中AMP抗性基因前后的载体骨架结构优选BpiI和HindIII双酶切的结构。更佳的，在Amp抗性基因和在其前和/ 或后插入了长度为1000 2000bp，优选1500bp的无义序列后的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。本专利技术的第二方面是提供一种T载体，由如上所述的前T载体经kml或kml同裂酶酶切而得。其中，所述T载体较佳的为图4所示的pXL-T，图5所示的pXL01_T或图6所示的 PXL02-T。本专利技术的第三方面是提供一种制备所述的前T载体的方法，包括以下步骤1) WpBlueScript II SK (-), pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pUC19，或 pGEM 系列载体为出发载体，在其多克隆位点引入引入)(cml盒，得到前T载体；所述的)(CmI盒包括 ccdB基因序列以及紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个kml酶切位点序列；2)将所述出发载体中的Amp抗性基因延长。其中，步骤幻中较佳的在载体的Amp抗性基因前和/或后插入无义序列，从而延长。例如将pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因用来自载体pJETl. 2的AMP抗性基因及其前后的载体骨架(如载体PJET1. 2的BpiI和HindIII双酶切片段)替换，即得。所述的Amp抗性基因延长后优选如序列表中SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本专利技术的第四方面是提供所述的前T载体和T载体在基因克隆中的应用。本专利技术所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。采用本本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种前Ｔ载体，其特征在于，是以已知载体为出发载体进行改良后的载体，出发载体是ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－），ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＵＣ１９，或ｐＧＥＭ系列载体，它们的多克隆位点被替换为ＸｃｍＩ盒，所述的ＸｃｍＩ盒包括ｃｃｄＢ基因序列以及紧密连接于所述ｃｃｄＢ基因序列两侧的各一个ＸｃｍＩ酶切位点序列，并且出发载体中的抗性基因前和／或后插入了长度为１０００～２０００ｂｐ的无义序列而被延长。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖爱军，周磊，赫英俊，
申请(专利权)人：上海捷瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31