微生物来源的抗氧化剂制备方法技术

微生物来源的抗氧化剂制备方法，它涉及抗氧化剂制备方法。它解决了现有提取方法得到的菌产抗氧化剂存在杂质较多，抗氧化活性低的问题。方法：制青霉JTLR-1的培养物；培养物反复冻融并研碎后，制无水提取物；制无水提取物乙酸乙酯溶液并上样于硅胶填料，弃去乙酸乙酯溶液；乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合后洗脱硅胶，弃去洗脱液；继续洗脱硅胶，收集洗脱液，减压除去溶剂即完成。本发明专利技术中的制备方法可以除去较多杂质，且得到的抗氧化剂比现有提取方法浓缩了至少6倍以上，可见抗氧化活性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗氧化剂制备方法。
技术介绍
自由基是生命活动中多种生化反应的中间代谢物质。自由基产生过多或清除过慢，会造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。在衰老过程中，机体内氧化和抗氧化系统之间的平衡发生了变化，表现为氧化作用增强，抗氧化能力减弱随着年龄的增长，抗氧化酶类如SOD等活性降低，体内除氧自由基的能力受到影响，氧自由基浓度升高，引起膜脂质的过氧化、蛋白质变性、酶活性降低和DNA损伤等危害些生物大分子结构与功能的改变，必然导致细胞功能的紊乱，从而导致各种疾病和引起衰老。因此说自由基攻击生命大分子和各种细胞器造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重大原因。抗氧化物质(抗氧化剂)是指能够清除氧自由基，抑制或消除以及减缓氧化反应的一类物质。抗氧化剂的开发与研究一直以来受到人们的广泛关注，特别是当科学家们发现人体的疾病与衰老是人体内自由基作用的结果后，抗氧化剂的研究更有了广阔的发展空间。天然抗氧化剂已从单纯作为油脂和含脂食品的抗氧化剂，发展到作为体内氧自由基的清除剂，起到保护人体细胞组织，保护心脑血管循环系统、抗癌及延缓衰老等生理作用。目前天然抗氧化物质主要是从动植物中提取的，如维生素类、酶类和天然药物类等。但是动植物中天然抗氧化物质含量较低，提取工艺复杂，而且从这些资源提取势必使这这些动植物资源遭到严重破坏，造成生物多样性和生态环境的损失。近年来，利用一些微生物具有产生和宿主相同或相似生理活性物质的特点，对植物来源菌进行了大量的研究，已从榛属植物中分离得到多株可以产生具有生理活性物质的菌株，其中包括可以产生抗氧化剂的青霉(产抗氧化剂的菌株为青霉JTLR-1，分类命名为青霉Penicillium sp，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年3月21日，保藏编号为CGMCC No. 4701)。名称为“一株产抗氧化剂的菌株(申请号201110111548X，申请日2011年04月四日)”的专利中利用青霉JTLR-I产抗氧化剂的提取方法(具体如下取青霉JTLR-I的发酵固体培养物用液氮冷冻并研碎后，以Ig固体培养物加入IOmL质量浓度50%的甲醇水的比例进行提取，用正己烷萃取，直至正己烷萃取液无色后，除去上层正己烷层，取下层冷冻干燥，即得到菌产抗氧化剂)存在杂质较多，抗氧化活性低的问题。
技术实现思路
本专利技术目的是为了解决现有提取方法得到的菌产抗氧化剂存在杂质较多，抗氧化活性低的问题，而提供。按以下步骤进行一、将1 2环青霉JTLR-I接种于PDA固体培养基，在下培养2天，然后转接于装有200mL察氏培养基的500mL三角瓶中，在、180r/min条件下摇瓶培养7天，收集液体发酵培养物；二、液体发酵培养物过滤后取固形菌丝，然后用液氮反复冻融并研碎后，加入蒸馏水形成过40目标准筛的流体， 再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液无色后取水层加入萃取溶剂进行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入无水Na2SO4除水，过滤去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下减压除去溶剂，得到无水提取物；三、取Ig无水提取物溶解于1 IOOml乙酸乙酯，得无水提取物乙酸乙酯溶液，然后上样于硅胶填料，上样流速为0. 1 lOmL/min，弃去流经硅胶填料的乙酸乙酯溶液；四、按体积比20 100将乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合，然后洗脱硅胶，洗脱流速为0. 1 lOOmL/min，洗脱体积为硅胶体积的10 20倍，弃去洗脱液；五、按体积比20 100 100将乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合，继续洗脱硅胶，洗脱流速为0.1 lOOmL/min，洗脱体积为硅胶体积的10 20倍，收集洗脱液，在25 50°C下减压除去溶剂，得到具抗氧化作用物质的提取物，即完成微生物来源的抗氧化剂制备；其中步骤二中蒸馏水的加入量为每Ig研碎后物质加1 20ml蒸馏水；步骤二中水层与萃取溶液的体积比为1 1 ；步骤三中上样的量按无水提取物质量计，无水提取物与硅胶的质量比为1 1 100，硅胶的粒径为5 μ m 2_。按以下步骤进行一、将1 2环青霉JTLR-I接种于PDA固体培养基，在下培养3天，然后转接于装有50mL察氏培养基的大平皿中，在 25°C下培养7天得培养物；二、培养物用液氮反复冻融并研碎后，加入蒸馏水形成过40目标准筛的流体，然后用正己烷萃取，直至正己烷萃取液无色后取水层加入萃取溶剂进行萃取， 萃取三次，合并三次萃取液，然后加入无水N%S04除水，过滤去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下减压除去溶剂，得到无水提取物；三、取Ig无水提取物溶解于1 IOOml乙酸乙酯，得无水提取物乙酸乙酯溶液，然后上样于硅胶填料，上样流速为0. 1 lOmL/min， 弃去流经硅胶填料的乙酸乙酯溶液；四、按体积比20 100将乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合，然后洗脱硅胶，洗脱流速为0. 1 lOOmL/min，洗脱体积为硅胶体积的10 20倍，弃去洗脱液；五、按体积比20 100 100将乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合，继续洗脱硅胶，洗脱流速为0. 1 lOOmL/min，洗脱体积为硅胶体积的10 20倍，收集洗脱液，在25 50°C 下减压除去溶剂，得到具抗氧化作用物质的提取物，即完成微生物来源的抗氧化剂制备；其中步骤二中蒸馏水的加入量为每Ig研碎后物质加1 20ml蒸馏水；步骤二中水层与萃取溶液的体积比为1 1 ；步骤三中上样的量按无水提取物质量计，无水提取物与硅胶的质量比为1 1 100，硅胶的粒径为5 μ m 2匪。本专利技术，采用具有较高抗氧化活性的青霉JTLR-I 作为微生物来源；本专利技术中的制备方法可以除去较多杂质，且得到的抗氧化剂比现有提取方法浓缩了至少6倍以上，可见抗氧化活性高。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式按以下步骤进行 一、将1 2环青霉JTLR-I接种于PDA固体培养基，在下培养2天，然后转接于装有 200mL察氏培养基的500mL三角瓶中，在、180r/min条件下摇瓶培养7天，收集液体发酵培养物；二、液体发酵培养物过滤后取固形菌丝，然后用液氮反复冻融并研碎后，加入蒸馏水形成过40目标准筛的流体，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液无色后取水层加入萃取溶剂进行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入无水Na2SO4除水，过滤去除固形物后得到提取液，再在25 50°C下减压除去溶剂，得到无水提取物；三、取Ig无水提取物溶解于1 IOOml乙酸乙酯，得无水提取物乙酸乙酯溶液，然后上样于硅胶填料，上样流速为 0. 1 lOmL/min，弃去流经硅胶填料的乙酸乙酯溶液；四、按体积比20 100将乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合，然后洗脱硅胶，洗脱流速为0. 1 lOOmL/min，洗脱体积为硅胶体积的 10 20倍，弃去洗脱液；五、按体积比20 100 100将乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合， 继续洗脱硅胶，洗脱流速为0. 1 lOOmL/min，洗脱体积为硅胶体积的10 20倍，收集洗脱液，在25 50°C下减压除去溶剂，得到具抗氧化作用物质的提取物，即完成微生物来本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．微生物来源的抗氧化剂制备方法，其特征在于微生物来源的抗氧化剂制备方法按以下步骤进行：一、将１～２环青霉ＪＴＬＲ－１接种于ＰＤＡ固体培养基，在２８℃下培养２天，然后转接于装有２００ｍＬ察氏培养基的５００ｍＬ三角瓶中，在２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ条件下摇瓶培养７天，收集液体发酵培养物；二、液体发酵培养物过滤后取固形菌丝，然后用液氮反复冻融并研碎后，加入蒸馏水形成过４０目标准筛的流体，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液无色后取水层加入萃取溶剂进行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入无水Ｎａ２ＳＯ４除水，过滤去除固形物后得到提取液，再在２５～５０℃下减压除去溶剂，得到无水提取物；三、取１ｇ无水提取物溶解于１～１００ｍｌ乙酸乙酯，得无水提取物乙酸乙酯溶液，然后上样于硅胶填料，上样流速为０．１～１０ｍＬ／ｍｉｎ，弃去流经硅胶填料的乙酸乙酯溶液；四、按体积比２０∶１００将乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合，然后洗脱硅胶，洗脱流速为０．１～１００ｍＬ／ｍｉｎ，洗脱体积为硅胶体积的１０～２０倍，弃去洗脱液；五、按体积比２０～１００∶１００将乙酸乙酯溶液和无水乙醇混合，继续洗脱硅胶，洗脱流速为０．１～１００ｍＬ／ｍｉｎ，洗脱体积为硅胶体积的１０～２０倍，收集洗脱液，在２５～５０℃下减压除去溶剂，得到具抗氧化作用物质的提取物，即完成微生物来源的抗氧化剂制备；其中步骤二中蒸馏水的加入量为每１ｇ研碎后物质加１～２０ｍｌ蒸馏水；步骤二中水层与萃取溶液的体积比为１∶１；步骤三中上样的量按无水提取物质量计，无水提取物与硅胶的质量比为１∶１～１００，硅胶的粒径为５μｍ～２ｍｍ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金涛，葛菁萍，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93