从青花菜花椰菜提取萝卜硫苷化合物的方法技术

本发明专利技术公开了从青花菜花椰菜提取萝卜硫苷化合物的方法，属于植物组分提取技术领域。该方法包括：(1)青花菜花椰菜植物材料的选择与预处理；(2)提取试剂，粗提及浓缩；(3)粗提液的有机溶剂萃取及去杂；(4)萃取液的初步纯化；(5)色谱柱纯化萝卜硫苷等步骤、工艺。具有提取纯化方法简单，萝卜硫苷提取得率高，组分单一纯度高等特点，本发明专利技术产品可作为标准品应用于生物化学实验及相关研究中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物组分提取
，尤其涉及一种利用青花菜和花椰菜为材料， 提取高纯度防癌抗癌化学保护剂前体萝卜硫苷的方法。
技术介绍
近年来，许多流行病学研究发现食用十字花科蔬菜可以降低癌症的发生，其中，食用青花菜和花椰菜的芽苗菜或者大剂量的花球O50克/天)，可以减少DNA损伤，提高阶段2酶的活性，从而防止和减少癌症的发生。研究表明，青花菜中一种由芥子油苷-萝卜硫苷甲基亚磺酰丁基芥子油苷)降解产生的萝卜硫素作为阻遏因子，通过双重机制特异地调节致癌代谢。萝卜硫素是蔬菜中发现的抗癌活性最强的植物化学物质，对肺癌、肠癌、 前列腺癌以及乳腺癌等多种癌症都有很强的抑制功效。最近的研究表明，萝卜硫素和其他一些芥子油苷代谢产物可能通过阻断细胞循环以及促进癌细胞凋亡而阻碍肿瘤的生长。但萝卜硫素化学性质不稳定，易分解，而其前体萝卜硫苷相对稳定，并在人体内可被肠道微生物降解生成具有抗癌和防癌活性的异硫代腈酸盐萝卜硫素，因此萝卜硫苷便可作为食品、 保健品或药品的添加剂。此外，萝卜硫苷的降解产物萝卜硫素对多种植物的病原菌如一些尖孢镰刀菌、假单孢杆菌等具有抑制作用，其降解产物腈类物质还参与了对多种昆虫如蚜虫、小菜蛾等的防卫，因此萝卜硫苷是一种具有多种生物学功能的植物化学物质。目前，国际上可以出售的标准品芥子油苷只有2-丙烯基芥子油苷和苯甲基芥子油苷两种，并分别由Sigma-Aldrich和AppliChem两家公司生产，且价格昂贵，而具有较强抗癌和防癌活性的前体物质萝卜硫苷尚无公司出售。因此，利用自有丰富的青花菜或花椰菜种质资源，研制开发出自主的萝卜硫苷，无疑是一项富有意义的工作。
技术实现思路
本专利技术目的是，针对目前芥子油苷产品种类较少，且依赖国外进口，价格昂贵的缺陷，提供一种以青花菜花椰菜植物为材料，从中提取萝卜硫素的前体并能参与十字花科植物多种防卫反应的萝卜硫苷化合物的方法。本专利技术目的通过以下技术方案得以实现。，该方法按如下步骤进行(1)青花菜花椰菜植物材料的选择与预处理选择含萝卜硫苷占总脂肪类芥子油苷90%以上且占总芥子油苷80%以上的青花菜花椰菜的种子、芽苗、茎叶和花器官为材料，在避免如刀割、压挤、磨损破碎性物理伤害前提下，用水清洗、浙干后，备用；(2)提取试剂，粗提及浓缩以水、甲醇或80%甲醇水溶液为提取试剂；将提取试剂与青花菜花椰菜预处理后的植物材料，按体积重量1-3L l_2kg的比例和85-100°C、搅拌浸泡20-30min的相同工艺重复提取2_3次，分别经过滤、超滤除去不溶物后合并滤液，经旋转蒸发或冷冻干燥后溶于占提取试剂1-2%体积的水中后得萝卜硫苷粗提液；(3)粗提液的有机溶剂萃取及去杂将萝卜硫苷粗提液用有机溶剂交互反复萃取至无色；收集水相，经过滤、超滤或离心除去不溶物，收集上清液；(4)萃取液的初步纯化将萃取液的上清液按以下程序进行初步纯化1)按照 l-2g树脂提取IOOmg萝卜硫苷的比例称取DEAE-S^hadex A-25阴离子交换树脂后，用 80-100%甲醇溶液浸泡10-Mh，装入柱床高于5cm的玻璃柱中；2)用3_5倍于阴离子交换树脂体积的浓度为0-10%甲醇水溶液进行洗柱；幻将除去不溶物后的水相部分上样；4)用两倍柱床体积的水淋洗后，再用等柱床体积的20%异丙醇或20%乙腈溶液为淋洗液进行淋洗力)用2-3倍柱床体积的并与上述淋洗液相配套的阴离子交换液进行洗脱，并收集到与阴离子交换液等体积的无水乙醇中；6)洗脱液经旋转蒸发干燥后溶于水，经0. 22μπι水相滤膜超滤后得到含有多种芥子油苷组分的混合液；(5)色谱柱纯化萝卜硫苷以制备型或半制备型色谱柱为纯化柱，将初步纯化混合液分次进样，以含0. 三氟乙酸的水和含0. 三氟乙酸的乙腈为流动相，乙腈浓度按初始的0-5%持续5min，5-20%持续20min，20%维持5min设置梯度，在流速2_;3ml/min，检测波长210-230nm下，收集最高色谱峰出峰期间流出的流动相；将上述分次进样、收集后的流动相合并，经冷冻干燥、旋转蒸发或氮气吹干干燥后，即获得纯度高于95%的萝卜硫苷产品；萝卜硫苷的含量参照Sun et al.，Food Chemistry, (2011)方法进行定量。所述用于萃取的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和正己烷。所述的阴离子交换液为含有0. 5M氯化钾、氯化钠、硫酸钾或硫酸钠的5-20%的异丙醇溶液或含有0. 5M氯化钾、氯化钠、硫酸钾或硫酸钠的5-20%的乙腈溶液，其中，步骤 (4)-4)以20%异丙醇为淋洗液则使用前者作为阴离子交换液，若步骤0)-4)以20%乙腈为淋洗液则使用后者作为阴离子交换液。所述的20%异丙醇溶液，20%乙腈溶液，5-20%异丙醇溶液，5-20%乙腈溶液均为相应浓度异丙醇或乙腈的水溶液。所述的色谱柱为制备或半制备型，以ODS BP为填料、粒径为5-10μπκ柱长为 25-30cm、直径为10-20mm的反相硅胶填料柱。所述的旋转蒸发或氮气吹干燥方法，其温度不超过50°C。所述萝卜硫苷的含量采用Sun et al.，Food Chemistry, (2011)方法进行定量测定。本专利技术的有益效果是本专利技术以富含萝卜硫苷的青花菜和花椰菜植物为材料，用水或甲醇溶液提取芥子油苷复合物，通过萃取和阴离子交换树脂进行初步纯化，经浓缩后，再利用半制备型或制备型色谱柱即可提取纯度高达95%以上的萝卜硫苷化合物，该方法具有方法简单，成本低廉， 萝卜硫苷提取得率高，组分单一纯度高，可作为标准品应用于生物化学实验及相关研究中。本专利技术提取的萝卜硫苷是具有防癌抗癌化学保护剂一一萝卜硫素的前体；也能参与多种十字花科植物抵御多种植物病原菌和昆虫的重要物质。附图说明图1.从青花菜花椰菜提取、纯化萝卜硫苷工艺流程图。图2.选择用于制备萝卜硫苷的青花菜品种中芥子油苷高效液相色谱图。标准品为2-硝基苯-β -D-半乳糖苷(120uM)，检测方法参照Sun et al.，FoodChemistry, (2011)，材料中萝卜硫苷占总芥子油苷的98%，占脂肪类芥子油苷的98. 4%。图3.萝卜硫苷富集纯化前、后的色谱图。其中，浓度为5mM，2-丙烯基芥子油苷(sinigrin)作为内标，浓度为3mM图A为半制备柱纯化前蒸发光检测完型萝卜硫苷结果；图B为半制备柱纯化后脱硫萝卜硫苷定量检测结果。具体实施例方式通过以下实施例对本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的内容并不局限于此。本专利技术所涉及的仪器和材料如下液相系统为美国Waters公司，包括泵Watersl525，自动进样系统717plus Autosampler，检测器 Waters2487 ；所用水为超纯水，乙腈和三氟乙酸为色谱纯均由美国TEDIA公司生产；所用色谱柱为大连依利特公司生产，其中半制备型色谱柱填料为SinoChrom ODS-BP C18，粒径5 μ m、柱长25cm、直径10mm，制备型色谱柱填料为SinoChrom ODS-BP C18, 粒径10 μ m、柱长30cm、直径20mm ；萝卜硫苷是属于脂肪类芥子油苷中的一种；不同青花菜和花椰菜材料内所含芥子油苷的组分和含量存在差很大的差异；故在选择植物材料时，首先需要选择含萝卜硫苷含量和比例高的植物为材料，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．从青花菜花椰菜提取萝卜硫苷化合物的方法，其特征在于按如下步骤进行：（１）青花菜花椰菜植物材料的选择与预处理：选择含萝卜硫苷占总脂肪类芥子油苷９０％以上且占总芥子油苷８０％以上的青花菜花椰菜的种子、芽苗、茎叶和花器官为材料，在避免如刀割、压挤、磨损破碎性物理伤害前提下，用水清洗、沥干后，备用；（２）提取试剂，粗提及浓缩：以水、甲醇或８０％甲醇水溶液为提取试剂；将提取试剂与青花菜花椰菜预处理后的植物材料，按体积重量１－３Ｌ∶１－２ｋｇ的比例和８５－１００℃、搅拌浸泡２０－３０ｍｉｎ的相同工艺重复提取２－３次，分别经过滤、超滤除去不溶物后合并滤液，经旋转蒸发或冷冻干燥后溶于占提取试剂１－２％体积的水中后得萝卜硫苷粗提液；（３）粗提液的有机溶剂萃取及去杂：将萝卜硫苷粗提液用有机溶剂交互反复萃取至无色；收集水相，经过滤、超滤或离心除去不溶物，收集上清液；（４）萃取液的初步纯化：将萃取液的上清液按以下程序进行初步纯化：１）按照１－２ｇ树脂提取１００ｍｇ萝卜硫苷的比例称取ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ－２５阴离子交换树脂后，用８０－１００％甲醇溶液浸泡１０－２４ｈ，装入柱床高于５ｃｍ的玻璃柱中；２）用３－５倍于阴离子交换树脂体积的浓度为０－１０％甲醇水溶液进行洗柱；３）将除去不溶物后的水相部分上样；４）用两倍柱床体积的水淋洗后，再用等柱床体积的２０％异丙醇或２０％乙腈溶液为淋洗液进行淋洗；５）用２－３倍柱床体积的并与上述淋洗液相配套的阴离子交换液进行洗脱，并收集到与阴离子交换液等体积的无水乙醇中；６）洗脱液经旋转蒸发干燥后溶于水，经０．２２μｍ水相滤膜超滤后得到含有多种芥子油苷组分的混合液；（５）色谱柱纯化萝卜硫苷：以制备型或半制备型色谱柱为纯化柱，将初步纯化混合液分次进样，以含０．１％三氟乙酸的水和含０．１％三氟乙酸的乙腈为流动相，乙腈浓度按初始的０－５％持续５ｍｉｎ，５－２０％持续２０ｍｉｎ，２０％维持５ｍｉｎ设置梯度，在流速２－３ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长２１０－２３０ｎｍ下，收集最高色谱峰出峰期间流出的流动相；将上述分次进样、收集后的流动相合并，经冷冻干燥、旋转蒸发或氮气吹干干燥后，即获得纯度高于９５％的萝卜硫苷产品；萝卜硫苷的含量参照Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２０１１）方法进行定量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王建升，顾宏辉，虞慧芳，赵振卿，盛小光，张晓辉，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：86