用于治疗性克隆的人体细胞组织器官保存方法技术

本发明专利技术涉及对人活细胞、活组织和活器官以及原代细胞、继代细胞和细胞株的体外保存技术。它包括将人各种组织细胞浸入冷冻保护液，与冷冻保护液充分混匀，冷冻保护液有效地渗透入组织，分阶段地将温度降至预定温度。冷冻组织细胞在使用前可无限期保存。可用于治疗性器官克隆的供体细胞或细胞核。此外冻存的人体组织，细胞解冻复苏后体外培养可作为功能基因组学研究，疾病相关基因筛选以及筛选有生物活性的化合物的原料。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

Human cell tissue and organ preservation method for therapeutic cloning

The invention relates to a method for in vitro preservation of human living cells, living tissues and living organs, as well as primary cells, secondary cells and cell lines. The utility model comprises the following steps that: all kinds of tissue cells are immersed in the freezing protection liquid, and the liquid is fully mixed with the freezing protection liquid. Frozen tissue cells can be stored indefinitely before use. Donor cells or nuclei for the treatment of sexual organ cloning. In addition, the cryopreserved human tissues and cells can be used as functional genomics research, disease related gene screening and screening of bioactive compounds.

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及冻存技术，尤其是人体细胞组织器官(如脐带组织和脐带相关细胞)的体外冻存技术，其中冻存的细胞被用于治疗性克隆及其它用途。通过本专利技术的冻存技术，冻存的组织和细胞可以在复苏使用前无限期保存。当冻存的组织和细胞被复苏后，可用于治疗性克隆和移植、功能基因组学研究、疾病相关基因筛选以及筛选有生物活性的化合物的原料。目前，生物材料的储存时间是由生物材料降温至冷冻保存温度的过程所决定的。降温过程中细胞内外的水分从液体状态到固体状态要经历结冰过程，包括水分子的有序排列——结晶化或非结晶化过程。对于冷冻学家而言，其技术关键在于使细胞进入冷冻温度后仍能使其回到生理状态而没有损伤。细胞和组织冻存的两个关键步骤是冻融和结晶。冻融技术要求细胞外液体结冰，但采用了很多步骤来减少细胞内结冰。有人建议采用全样本冻存，但仍无法防止细胞内结冰，正是这些冰晶在冻融中对细胞造成致命的损伤。另一技术是结晶技术，其中试图采用高浓度液体和/或多聚体来减少冰晶形成。然而长久地暴露于高浓度甚至毒性水平的结晶添加剂中对细胞的损害亦很大。在人体的各种细胞组织器官中，脐带组织和脐带相关细胞一直被认为是生物学废物，在胎儿出生后予以废弃，尽管有些脐带组织和脐带相关细胞可作为人体细胞来源而用于体外研究，但通常为短期研究。并没有将脐带组织和脐带相关细胞经过冻存，解冻后再用于研究的报道。近年来，随着体细胞克隆技术、治疗性器官克隆和同种或异种移植技术的发展和成功，要求一种能长期保存脐带组织和脐带相关细胞的方法，确保脐带组织和脐带各种细胞在长期乃至无限期的保存后能安全复苏，并且保持其理化性质不变，以便为脐带提供者本人或他人提供器官克隆、移植、功能基因组学研究、疾病相关基因筛选以及筛选有生物活性的化合物的原料所用。因此，本专利技术的目的在于提供一种对用于治疗性克隆的人体细胞组织器官进行冻存的方法，用该方法进行冻存的人体细胞、组织和器官，在解冻后能安全复苏并且保持理化性质不变，从而用于各种用途如制备治疗性克隆。在本专利技术的一个方面，提供了一种对用于治疗性克隆的人体细胞、组织或器官进行冻存的方法，该方法包括以下步骤(a)将获取的人体细胞、组织或器官浸入冷冻保护液，充分混匀冷冻保护液，使冷冻保护液充分渗透入该细胞、组织、器官；(b)起始温度设为20±5℃，以5-15℃/分钟降温至5-8℃，然后持续15-30分钟，进行点冰；(c)点冰以后，维持5±3分钟以使冷冻温度仍保持在5-8℃；(d)调整降温速度至-0.5至-1.5℃/分钟并将温度降至-8±1℃，维持30±20分钟；(e)以-0.1至-0.5℃/分钟的速度下降至低于-70℃的保存温度。较佳地，步骤(b)-(e)是在CO2缓冲环境中进行；而且，用液氮冷却的金属探棒点冰而形成细胞外点冰。较佳地，在冰晶形成后，温度以每分钟0.5至1.5℃(如1度)的速度下降至约-8℃，并保持10-50分钟以保证冷冻组织进入冷冻状态之前，在冷冻保护液中达到物理和生物学平衡状态。本专利技术还提供了将冻存的人体细胞、组织、器官解冻，用于制备治疗性克隆供核的方法，它包括将上述冻存的人体细胞组织器官在1-3分钟内快速解冻，然后在体外培养用作供核。在生物材料的冻存过程中，冷冻保护剂起的作用是保护结冰过程中细胞的活性。冷冻保护剂的主要通过以下方式起到保护作用，即当水转变成冰且盐离子浓度升高时，起稀释作用。结冰量取决于温度和溶液组分。另外，冷冻保护剂还能降低细胞内的结冰温度、稳定细胞膜和蛋白。所有的溶液在形成冰晶核心之前都能在低于其冰点的温度下过冷而不冻结。当用冻融法冻存时，细胞外介质的冻结出现在过冷低点时的点冰。非点冰引起的结冰是在溶液温度大大地低于冰点时的自发结冰。因为该过程是自发的，结冰随机发生于无法预见的温度下，因此在同样的冻存程序下细胞的存活力差异很大。另外，当极度过冷时发生的快速结冰易造成细胞和组织损伤。另外，如果细胞外结冰发生极度过冷时，细胞内冰形成的可能性大大增加。这一现象源于结冰导致的细胞脱水延迟发生，进一步增加细胞内水的潴留，从而使细胞内结冰的可能性又大大地增加了。一旦细胞外点冰完成，样品被冰包围，样品就能降温至冻存状态。降温步骤是冻融法中的关键点。部分结冰的细胞外溶液浓度高于细胞内溶液，为达到热力学平衡，细胞丢失水分而脱水。随着细胞外冰的逐渐增多，脱水愈加严重。细胞的三个特性决定其脱水的速度(1)细胞膜的水渗透率(水渗透率愈差，细胞脱水的时间愈长)；(2)细胞膜水渗透率的温度依赖性(所有细胞膜在温度降低时其水渗透率下降)；(3)细胞的大小(大细胞比小细胞需要更长的时间发生脱水)。由于各细胞的特性各不相同，其冻存的优选条件就有一定的差异。尽管，冻存时细胞损伤的确切机制尚未完全阐明，然而通过细胞活力测定发现，非常快和非常慢的冷却速度都大大地降低细胞活力，中等冷却速度产生最优选的结果。尽管对于不同的细胞，其优选冷却速度和降温曲线可以差别很大，但冷冻的总体程度是相近的。过快冷冻细胞没有足够的时间脱水而形成细胞内冰，细胞损伤主要归因于细胞内冰。过慢冷冻时，细胞损伤主要因为过长时间暴露于高浓度的细胞内和细胞外的盐分以及冷冻保护液，或细胞外冰和细胞之间的相互作用。在细胞内冰核形成之前必须使细胞脱水。当细胞在1M和2M浓度的冷冻保存液内时，细胞脱水这一事件多发生在-50℃-40℃之间。值得一提的是，细胞内的结冰量在降温中可能不会对细胞造成伤害，但如果解冻不够快的话，细胞会因为溶解时发生肿胀而死亡。利用本专利技术的组织和细胞冷冻方法，可以在低温下避免细胞内冰晶形成和细胞毒性化学试剂的使用，利用程序冷冻仪在适当降温速度下进行冷冻保护组织。该组织和细胞的冷冻保存方法使组织和细胞能无限期保持其活力和生理特性，以供器官克隆、移植、体外检测以及其他功用方面的应用。本专利技术提供的对用于治疗性克隆的人体细胞组织器官进行冻存的方法，包括步骤(a)将获取的人体细胞、组织或器官浸入冷冻保护液，充分混匀冷冻保护液，使冷冻保护液充分渗透入该细胞、组织、器官；(b)起始温度设为20±5℃，以5-15℃/分钟降温至5-8℃，然后持续15-30分钟，进行点冰；(c)点冰以后，维持5±3分钟以使冷冻温度仍保持在5-8℃；(d)调整降温速度至-0.5至-1.5℃/分钟并将温度降至-8±1℃，维持30±20分钟；(e)以-0.1至-0.5℃/分钟的速度下降至低于-70℃的保存温度。适用于本专利技术方法的人体细胞组织器官可以是任何的人体细胞、组织和器官，其中包括(但并不限于)脐带相关细胞、皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞；脐带组织、皮肤、乳腺等。在本申请中，“脐带相关细胞”指来源于脐带的各种细胞，包括消化后体外培养的脐带组织的各种细胞，如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等。“脐带组织”指脐带的全部组织，包括小段、切片等。在本专利技术方法中，冻存温度一般为低于-70℃，较佳地为不大于-120℃，更佳地为不大于-140℃，最佳地为不大于-196℃。如为短期保存(运输途中)可置于-76℃(干冰的温度)。长期保存时，温度宜更低，例如采用液氮保存(-196℃)。适用于本专利技术方法的冷冻保护液包括细胞渗透性晶体形成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对用于治疗性克隆的人体细胞、组织或器官进行冻存的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（ａ）将获取的人体细胞、组织或器官浸入冷冻保护液，充分混匀冷冻保护液，使冷冻保护液充分渗透入该细胞、组织、器官；（ｂ）起始温度设为２０±５℃， 以５－１５℃／分钟降温至５－８℃，然后持续１５－３０分钟，进行点冰；（ｃ）点冰以后，维持５±３分钟以使冷冻温度仍保持在５－８℃；（ｄ）调整降温速度为－０．５至－１．５℃／分钟并将温度降至－８±１℃，维持３０±２０分钟；（ｅ）以－ ０．１至－０．５℃／分钟的速度下降至低于－７０℃的保存温度。

【技术特征摘要】
1．一种对用于治疗性克隆的人体细胞、组织或器官进行冻存的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(a)将获取的人体细胞、组织或器官浸入冷冻保护液，充分混匀冷冻保护液，使冷冻保护液充分渗透入该细胞、组织、器官；(b)起始温度设为20±5℃，以5-15℃/分钟降温至5-8℃，然后持续15-30分钟，进行点冰；(c)点冰以后，维持5±3分钟以使冷冻温度仍保持在5-8℃；(d)调整降温速度为-0.5至-1.5℃/分钟并将温度降至-8±1℃，维持30±20分钟；(e)以-0.1至-0.5℃/分钟的速度下降至低于-70℃的保存温度。2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)-(e)是在CO2缓冲环境中进行；而且，用液氮冷却的金属探棒点冰而形成细胞外点冰；3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，冰晶形成后，温度以每分钟1度的速度下降至-8℃，并保持10-50分钟以保证冷冻组织进入冷冻状态之前，在冷冻保护液中达到物理和生物学平衡状态。4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，人体细胞组织器官选自下组脐带相关细胞、皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉...

【专利技术属性】
技术研发人员：成国祥，
申请(专利权)人：上海杰隆生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]