本发明专利技术公开了一种心肌特异性同源盒部分多肽及其应用。本发明专利技术的心肌特异性同源盒部分多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列1。所述多肽与载体蛋白偶联可形成复合蛋白。所述载体蛋白可以为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。所述复合蛋白和免疫佐剂混合的混合物可作为免疫原。本发明专利技术的免疫原免疫动物获得了较高效价的免疫血清，经ELISA检验效价高于1∶62500，免疫血清能在细胞水平上检测禽源心肌特异性同源盒的表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种心肌特异性同源盒部分多肽及其应用。
技术介绍
心脏发育是一个极其复杂的过程，它涉及到多种基因不同时间和不同空间的先后 表达与相互作用。Nkx2_5/Csx(cardiac specific homeobox)基因正是目前研究最多的与 心脏发育密切相关的转录因子之一，它属于NK型同源盒基因家族中NK2型(NK2-NK4)成 员。最初，人们应用果蝇同源结构域(homeodomain，HD)寡梭苷酸探针筛查果蝇DNA文库， 克隆出NK型同源盒基因，随后分离出一种与果蝇背侧血管/心脏发育密切相关的果蝇NK2 型基因-tin基因。当tin基因发生突变时会导致果蝇心脏形成异常。该类基因在进化中的 高度保守性，1993年研究人员应用cDNA文库筛查、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、 RT-PCR和原位杂交等分子技术分别在两栖类和啮齿类动物体中分离出Nkx2_5基因并证实 其确实与果蝇tin基因高度同源。1995年Lyons等报道了靶性破坏Nkx2_5基因的小鼠产 生心脏发育的异常，同时又有学者分离出人类Nkx2_5基因，并将其定位染色体5q34。1996 年Turbay等在成人心脏cDNA文库中分离出Nkx2_5基因，进一步将其定位于染色体5q35。 1998年Schott等证实在人类先天性心脏病(congenital heart diesase，CHD)患者中确 实存在Nkx2_5基因的突变。针对人体及鼠等Nkx2. 5研究中均开发出特异性的抗体，使得 心脏发育研究进展得到很大提升。针对鸡Nkx2. 5特异性的抗体目前还没有专利
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种心肌特异性同源盒部分多肽及其应用。本专利技术所提供的心肌特异性同源盒(Nkx2. 5)部分多肽，其氨基酸序列为序列表 中的序列1。本专利技术的心肌特异性同源盒(Nkx2. 5)部分多肽，可用来制备免疫原，该免疫原免 疫动物可获得与心肌特异性同源盒(Nkx2. 5)特异结合的多克隆抗体。对在动物体内产生免疫反应而言，大多数多肽的分子量都太小，将多肽与载体蛋 白如匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白等交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。因此，本专利技术还提供了 一种复合蛋白。本专利技术所提供的复合蛋白是所述多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白。本专利技术的复合蛋白中，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。在免疫动物时，为了增强免疫原性通常将复合蛋白与免疫佐剂混合。本专利技术所提供的免疫原，是所述复合蛋白和免疫佐剂的混合物。本专利技术的与鸡心肌特异性同源盒(Nkx2. 5)特异结合的多克隆抗体，是用免疫原 免疫动物，采取免疫后动物的血液，获得的血清；所述免疫原是复合蛋白和免疫佐剂的混合 物；所述复合蛋白是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列 表中的序列1。本专利技术的与鸡心肌特异性同源盒(Nkx2. 5)特异结合的多克隆抗体，其中，所述载 体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。本专利技术的免疫原免疫动物获得了较高效价的免疫血清，经ELISA检验效价高于 1 62500，并且免疫印迹法证明该免疫血清能与禽源心肌特异性同源盒(Nkx23)特异结 合，免疫血清能在细胞水平上检测禽源心肌特异性同源盒(Nkx2.5)的表达。附图说明图1为免疫印迹法检测免疫血清的特异性。图2为空白对照组激光共聚焦显微镜下显示结果的图片；A为相差图像，B为荧光图像，C为叠加图像。图3为对照血清组激光共聚焦显微镜下显示结果的图片；A为相差图像，B为荧光图像，C为叠加图像。图4为免疫血清组激光共聚焦显微镜下显示结果的图片；A为相差图像，B为荧光图像，C为叠加图像。具体实施例方式实施例1、与心肌特异性同源盒(Nkx2. 5)特异结合的多克隆抗体(一 )合成免疫原人工合成免疫多肽，其氨基酸序列为CSLEQEKRELEDPERPRQ。人工合成对照多肽，其氨基酸序列为CMELSSPSCMLAIFKQEA。对人工合成的多肽进行检测。结果表明，人工合成的免疫多肽分子量为2M2. 47Da，高效液相色谱O20nm，C18， 线性梯度)检测其纯度达92%。对照多肽分子量为1976. 32Da, HPLC检测纯度为90%。( 二 )与心肌特异性同源盒(Nkx2. 5)特异结合的多克隆抗体免疫多肽与载体蛋白按照质量比1 1偶联，形成多肽-载体复合蛋白，载体蛋白 可以为匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，本实施例为免疫多肽-KLH复合蛋白。对照多肽与KLH按照质量比1 1偶联，形成对照多肽-KLH复合蛋白。免疫多肽-KLH复合蛋白与费氏完全佐剂(Sigma)混合，制成免疫原。对照多肽-KLH复合蛋白与费氏完全佐剂(Sigma)混合，制成对照免疫原。用上述制备的免疫原和对照免疫原分别免疫SPF新西兰大耳兔。20周龄以内，2. 5-3Kg的SPF新西兰大耳兔，随机分成两组，免疫多肽组和对照多 肽组，每组2只。免疫多肽组注射免疫原，对照多肽组注射对照免疫原。免疫的具体过程如下第1周，每天多点背部皮下注射免疫SPF新西兰大耳兔一次，每只SPF新西兰大耳 兔注射免疫多肽-KLH复合蛋白或对照多肽-KLH复合蛋白的总量为0. Img ；第2周，对SPF新西兰大耳兔不做任何处理；第3周-第7周，每天多点背部皮下注射免疫SPF新西兰大耳兔一次，每只SPF新 西兰大耳兔注射免疫多肽-KLH复合蛋白或对照多肽-KLH复合蛋白的总量为0. Img ；第7周免疫结束，处死SPF新西兰大耳兔，从耳部及心脏采取150ml血液，用促凝 剂促凝，3000转离心20分钟。免疫多肽组获得免疫血清01和02。对照多肽组获得对照血清01和02。ELISA检测免疫血清和对照血清的效价，具体方法如下1)鸡心肌特异性同源盒(Nkx2. 5)用PBS配成100 μ g/ml的溶液，按100 μ 1/每孔 加入96孔酶标板，4°C过夜吸附；2)次日将过夜包被的酶标板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3% (质量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20,)封闭，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5小时；3)用PBS彻底洗2)中的沉淀4次后加入免疫血清或对照血清(用PBS按体积比 为 1 100、1 500、1 2500、1 12500 或 1 62500 稀释)，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5 小 时；4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(羊抗兔IgG用PBS按体积比为1 10000 稀释)，100 μ 1/每孔，37°C，lhr ；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP显色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ 1/每孔，避光反 应，加等体积0. 2Μ NaOH终止反应。6)取100 μ 1 5)中终止反应后的溶液100 μ 1，用酶标仪测定405nm下的OD值。实验重复三次，结果以三次的平均值表示。 血清效价检测结果如表1和图1所示；表1.血清效价检测结果权利要求1.一种多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列1。2.一种复合蛋白，是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为 序列表中的序列1。3.根据权利要求2所述的复合蛋白，其特征在于所述载体蛋白为本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马月辉，关伟军，王磊，侯玲玲，赵倩君，何晓红，傅宝玲，宫雪莲，冯宝刚，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11
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