本发明专利技术公开了用于基于聚合度分离和离析单独的极性质子单体和／或低聚物的方法。将包含单体和／或低聚物的液体样品引入用极性键合固定色谱相填充的液相色谱（ＬＣ）柱。通过两元流动相洗脱使所述单独的单体和／或低聚物分离。所述单体和／或低聚物可为原花色素、可水解的单宁、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇或聚乙烯醇。所述两元流动相包含基本由极性非质子溶剂组成的Ａ相和基本由极性质子溶剂组成的Ｂ相。本发明专利技术还公开了用于分离和离析黄嘌呤（例如咖啡因和可可碱）的方法。将包含黄嘌呤和单体和／或低聚物的液体样品引入用极性键合固定色谱相填充的ＬＣ柱。通过等度流动相洗脱分离黄嘌呤，并洗脱单独的流分。本发明专利技术还公开了用于分离和离析黄嘌呤合极性质子单体和／或低聚物的方法。在该方法中使用上述相。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及依据聚合度，利用二醇相液相色语(LC)分离并 优选回收包括但不限于黄烷-3-醇的单独的极性质子单体和/或低聚物 的改进方法。已知各种黄烷-3-醇具有不同性质，并对人和动物具有不同 用途。基于聚合度更有效地分离和回收单独的黄烷-3-醇将使其作用靶 向性更高和更力o有效。相关技术讨i仑原花色素，即黄烷-3-醇的低聚物和聚合物，为继木质素之 后含量第二丰富的天然植物酚。黄烷-3-醇单体主要通过一个单体4 位与另一个单体8位间的碳碳键(C4—C8)而连接在一起，少量通过 C4—C6键而连接在一起。原花色素包括B-型和A-型原花色素。在B-型原花色素中， 单体通过黄烷间C4—C6和/或黄烷间C4—C8 4建而连接在一起。只具 有C4—C8键的低聚物为线性，而至少一个C4—C6键的存在将导致 支化的低聚物。而A-型原花色素为包括在C2-0-C7以及在C4—C6 或C4—C8位键的双重连接低聚物。原花色素的分子量通常以聚合度(DP)表示。 一般将单独的 低聚物称作二聚物和三聚物等。原花青素为最大类的原花色素。Gu等表明发现41种食 物中包含原花色素，27种食物中包含原花青素(J. Agric. and Food Chem.)(2OO3》l:7513)。原花青素可包括(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素、 (+)-儿茶素和/或(-)-儿茶素单体单元，以及没食子酸化的单体，例如(-)-儿茶素没食子酸酯、(+)-儿茶素没食子酸酯、(-)表儿茶素没食子酸酯 和/或(+)-表儿茶素没食子酸酯。已知原花色素在植物食物的颜色稳定性、涩味和苦味中起 到重要作用。(见例如Haslam,"实用多畅、从分子^X别和生理作用角 度(Practical Polyphenols: From Molecular Recognition and Physiological Action)"(CambridgeU. Press, 1998))。然而，原花色素的名声却因这些 酚类化合物潜在的健康益处而得到了提高。(见例如Bagchi等，毒理 学(Toxicology) (2000) 148:187; Foo等，天然产物杂志(丄Natural Products) (2000) 63:1225; Steinberg等，Am. J. Clin. Nutri. (2003) 77:1466)。还已知用于人体和动物时各种原花青素4氐聚物具有特异性 质和潜在作用。例如，Tempesta公开了聚合度(DP)为2-11的原花青素低聚物具有明显的抗病毒活性，并用于治疗被副黏液病毒 (paramyxovaridae)(例如呼吸道合另包病毒)、正黏液病毒 (orthomyxovaridae)(例如流行性感冒病毒A、 B和C)以及疱渗病毒(例 如单纯疱渗病毒)感染的包括人在内的温血动物(美国专利5,211 ;944)。 Romanczyk Jr.等公开了包含DP为3-11的原花青素^f氐聚物和合适载体 的抗肿瘤组合物(美国专利5,554,645)。 Romanczyk Jr.等还公开了 DP 为5-12的原花青素低聚物用作抗氧化剂(美国专利5，891,905)。Schmitz 等公开了将DP为2-18的可可原花青素低聚物与乙酰水杨酸用于抗血 小板疗法(美国专利6,524,630)。因为其结构复杂性和性质多样性，原花色素的分析记载很 丰富(Santos-Buelga等，"多酚分析方法(Processes in Polyphenol Analysis)",皇家化学会(Royal Society of Chemistry) ， Cambridge, 2003 ， 267页)。Lea描述了将正相高效液相色谱(NP-HPLC)用于原花青素分 析(Lea等，食品和农业科学杂志(J. Sci. Food and Agriculture) (1979) 30:833)，并还观察到利用Sephadex LH-20柱在等度条件得到了其中 较大低聚物较较小低聚物保留时间更长的洗脱顺序(Ani. J. Enology and Viticulture (1979) 30:289)。 Wilson等公开了利用四氢呋喃-己烷-乙酸/曱酸-异丙醇梯度流动相通过氰基柱基于DP实现了苹果汁原花 青素的部分分离(食品农业科学(Sci. Food. Agric.) (1981) 32:257)。已在二氧化硅固定相上实现了原花青素低聚物分离和分 析的明显提高。见Rigaud等，Chromatogr. (1993) 654:179; Cheynier 等,酶学方法(Processes in Enzymology) (1999) 299; Natsume等，Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64:2581 。已实现五聚体(DP-5)原花青素低 聚物的分析。Hammerstone等公开了在分析未发酵的脱脂可可豆的过 程中改进该方法导致了单体至十聚体分离度的提高。见农业和食品化 学杂志(J. Agric. and Food Chem.) (1999) 47:490。 Gu等还公开了进一 步改进导致了十聚体(DP-10)的洗脱，以及整体峰形和分辨率的改善。 见农业和食品化学杂志(J. Agric. and Food Chem.) (2002)50:4852)。这些HPLC方法使用由二氯甲烷-甲醇-乙@^/曱酸-水组成 的梯度流动相，以实现直至五聚体的原花青素低聚物的分离，另一分 离苹果原花青素的方法利用己烷-曱醇-乙酸乙酯或己烷-丙酮，经二氧 化硅柱分离(Yanagida等，J. Chromatogr. A (2000) 890:251)。然而，包括Gu等的方法在内的现有HPLC方法具有不少 缺点。第一，使用氯化溶剂例如二氯甲烷会引起安全问题。当来自大 规模系统的离析的流分可能用于进一 步生物研究时，这尤其是个问 题。已知接触二氯甲烷会影响皮肤、眼睛、中枢神经系统(CNS)和心 血管系统，短期接触可导致疲劳、乏力、嗜睡、头晕、四月支麻痹、皮月夫发麻、恶心以及刺激皮肤和眼睛。长期接触二氯曱烷则与试验动物 的肺癌、肝癌和胰腺癌相关。二氯甲烷也是可导致出生缺陷的诱变剂， 如果妇女在怀孕过程中与其接触。已知另 一种常用的HPLC溶剂四氢呋喃(THF)剌激人体受 试体的眼睛，以及粘膜和胃肠道。过度接触THF可导致咳嗽、呼吸 急促、头昏、中枢神经系统(CNS)抑制、中毒和虚脱。用于分离原花青素低聚物的现有HPLC方法的其他问题 包括利用二氧化硅作为固定相时与原花青素的正相(NP)分离相关的 一贯性问题，即柱与柱之间的易变性。低聚物常常出现峰强度降低情 况或者完全检测不到，因为其可能被吸附在二氧化石圭表面。为原花青 素NP分离中峰形所需，在流动相中使用水，进一步降低了柱间重现 性。此外，从实际角度出发，大部分用于分离各种黄烷-3-醇(包括原 花青素低聚物)的现有HPLC方法涉及使用三或四元流动相，因此超 出了不具备复杂的四元HPLC泵的分析实验室的能力范围。需要基于DP识别单独的极性质子低聚物的改进方法，以 及基于DP分离和回收单独的极性质子低聚物的方法，所述方法避免 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于分离和洗脱选自以下的单独的极性质子单体和／或低聚物的高效液相色谱法：原花色素、可水解的单宁、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇，所述方法包括以下步骤： ａ．将包含所述单体和／或低聚物的液体样品引入用选自二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三甲基甲硅烷基相、二甲基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、苯基相、卤化相和硝基相的极性键合固定相填充的液相色谱柱； ｂ．使包含基本由极性非质子溶剂组成的Ａ相和基本由极性质子溶剂组成的Ｂ相的两元流动相流过所述柱子，以基于聚合度分离所述单独的单体和／或低聚物；和 ｃ．洗脱包含所述单体和／或低聚物的一个或多个单独流分。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：MA凯姆，CJ约翰逊，RJ罗宾斯，
申请(专利权)人：玛尔斯有限公司，
类型：发明
国别省市：US[]
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