本发明专利技术公开了一种能够检测山羊痘抗原的山羊痘反向间接血凝诊断试剂的制备方法及检测方法。制备方法为：以戊二醛和绵羊红细胞混合制备红细胞悬液，与等量的纯化山羊痘IgG混合，经搅拌、离心、洗涤，用含1%新生犊牛血清的PBS配成1%致敏红细胞，此即为山羊痘反向间接血凝诊断试剂。经优化的制备条件是：采用戊二醛单醛化法固定红细胞，致敏红细胞浓度0.8%～1.0%，IgG含量控制在1.5～1.55mg.ml-1，可以达到较好的标记效果；该试剂用于检测山羊痘病毒抗原按常规反向间接血凝试验方法进行，反应温度20～25℃，反应时间50min。该方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性，可用于兽医临床上山羊痘抗原快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
山羊痘是由山羊痘病毒属山羊痘病毒(goat poxvirus，GTPV)引起的一种呈地方流行的高度接触性传染病。一年四季均可发生，春秋常见，不分性别、年龄、品种。世界动物卫生组织(OIE)将山羊痘列为A类重大传染病，1999年中华人民共和国农业部第96号公告将山羊痘列为国家一类动物疫病。近年来，我国二十多个省市相继报导山羊痘发生流行，给我国蓬勃兴起的山羊养殖业造成了极大经济损失，带来了严峻的威胁。以往常用的琼脂扩散试验检测方法，具有敏感性低、检测速度慢、特异性不强等缺点ο为此，需要建立一种敏感、快速、准确、简便的方法来检测山羊痘病毒抗原，以用于山羊痘快速检测、诊断。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，提供一种，该山羊痘反向间接血凝诊断试剂能够快速、准确的检测山羊痘抗原，反向间接血凝试验敏感性更高、检测速度更快，用于兽医临床上山羊痘病毒抗原快速检测，为山羊痘的临床诊断与预防控制提供参考依据，以克服现有技术存在的敏感性低、检测速度慢、特异性不强等不足。本专利技术的山羊痘反向间接血凝诊断试剂，其制备方法包括以下步骤第一，无菌采集健康绵羊静脉血，加10倍量PBS，2 000转/分离心15分钟，洗5遍， 以0. IM pH 7. 4 7. 8的磷酸缓冲液配成2. 5%的红细胞悬液；第二，将步骤一制得的红细胞悬液与1%戊二醛以9:1体积比混合，于室温下缓慢搅拌 Ih, 2000转/分离心15分钟，用磷酸缓冲液洗5遍，重新制成2. 5%的醛化红细胞悬浮液； 第三，将步骤二制得的醛化红细胞悬浮液与等量1/200 000新鲜鞣酸溶液混合，置于 37°C的水浴锅中1小时后取出，用磷酸缓冲液洗涤3次，2000转/分离心15分钟，制成醛化、鞣化的沉淀红细胞；第四，将步骤三制得的沉淀红细胞加入10倍量0. IM pH 3 4的醋酸盐缓冲液中，再与等量纯化山羊痘IgG稀释液混合，置于37°C 2h，其间每隔15min吹吸混勻1次，制得0. 8% 致敏红细胞悬液；所使用的纯化山羊痘IgG含量控制在1. 5 1. 55mg/mL ； 第五，将步骤四制得的致敏红细胞2000转/分离心15分钟，取沉淀红细胞用含0. 1% NaN3、l%新生小牛血清的磷酸缓冲液洗涤5次，最后配成浓度0. 8% 致敏红细胞悬液诊断试剂；第六，分析检测合格即得反向间接血凝诊断试剂。山羊痘反向间接血凝诊断试剂检测山羊痘病毒抗原的方法，如上述所述的山羊痘反向间接血凝诊断试剂的制备方法制备的山羊痘反向间接血凝诊断试剂，检测步骤按常规反向间接血凝试验方法进行，其步骤为在96孔V形板中进行，每个样品为一组，每组1 12孔加入PBS 50 μ L，然后在第一孔加入待检样品50 μ L，用移液枪逐孔稀释至第11孔，弃 50μ L，第12孔为PBS空白对照。最后每孔加入山羊痘反向间接血凝诊断试剂50μ L，振荡混合后，置室温作用50min，判定结果。凡红细胞沉积于孔底，集中呈1个圆点的为不凝集； 如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱，以出现 50%以上凝集现象(++)的血清最高稀释度为检测抗体的效价。所述试剂的检测反应条件为反应温度20 25°C，反应时间50min。本专利技术有益效果本专利技术的诊断试剂及制备方法可用于兽医临床上山羊痘抗原的快速、大量检测，为山羊痘的临床诊断提供依据。与常用的琼脂扩散试验相比，反向间接血凝试验具有敏感性更高、检测速度更快、特异性更强的优点。附图说明图1为本专利技术的山羊痘反向间接血凝诊断试剂的制备流程图。 具体实施例方式具体实施例方式本专利技术的山羊痘反向间接血凝诊断试剂的各组分为磷酸缓冲液(0. ΙΜ,ρΗ 7. 4)、醋酸盐缓冲液(0. ΙΜ,ρΗ 3 4)、戊二醛、鞣酸、绵羊红细胞、纯化山羊痘IgG、新生犊牛血清、NaN3。如图1所示意，本专利技术的山羊痘反向间接血凝诊断试剂的的制备方法，包括以下步骤第一，无菌采集健康绵羊静脉血，加10倍量PBS，2 000转/分离心15分钟，洗5遍， 以磷酸缓冲液(0. 1M，pH 7.4)配成2. 5%的红细胞悬液；第二，将步骤一制得的红细胞悬液与1%戊二醛以9:1体积比混合，于室温下缓慢搅拌 Ih, 2000转/分离心15分钟，用磷酸缓冲液洗5遍，重新制成2. 5%的悬浮液；第三，将步骤二制得红细胞悬浮液与等量1 / 200 000新鲜鞣酸溶液混合，置于37°C 的水浴锅中1小时后取出，用磷酸缓冲液洗涤3次，2000转/分离心15分钟；第四，将步骤三制得的沉淀红细胞加入10倍量醋酸盐缓冲液(0. 1M, pH 3 4)中，再与等量纯化IgG稀释液混合，置于37°C池，其间每隔15min吹吸混勻1次；所使用的纯化山羊痘IgG含量为1. 549mg/mL ；第五，将步骤四制得的致敏红细胞2000转/分离心15分钟，取沉淀红细胞用含0. 1% NaN3、1 %新生小牛血清的磷酸缓冲液洗涤5次，最后配成0. 8% 1. 0%致敏红细胞悬液诊断试剂；第六，分析检测合格即制得反向间接血凝诊断试剂；山羊痘反向间接血凝诊断试剂检测山羊痘病毒抗原的方法，检测步骤按常规反向间接血凝试验方法进行，其步骤为在96孔V形板中进行，每个样品为一组，每组1 12孔加入PBS 50 μ L，然后在第一孔加入待检样品50 μ L，用移液枪逐孔稀释至第11孔，弃50 μ L， 第12孔为PBS空白对照。最后每孔加入山羊痘反向间接血凝诊断试剂50 μ L，振荡混合后， 置室温作用50min，判定结果。凡红细胞沉积于孔底，集中呈1个圆点的为不凝集；如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱，以出现50%以上凝集现象(++)的血清最高稀释度为检测抗体的效价。 所述试剂的检测反应条件为反应温度20 25°C，反应时间50min。权利要求1.一种山羊痘反向间接血凝诊断试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤第一，无菌采集健康绵羊静脉血，加10倍量PBS，2 000转/分离心15分钟，洗5遍， 以0. ΙΜ—ρΗ 7. 4 7. 8的磷酸缓冲液配成2. 5%的红细胞悬液；第二，将步骤一制得的红细胞悬液与1%戊二醛以9:1体积比混合，于室温下缓慢搅拌 Ih, 2000转/分离心15分钟，用磷酸缓冲液洗5遍，重新制成2. 5%的醛化红细胞悬浮液； 第三，将步骤二制得的醛化红细胞悬浮液与等量1 / 200 000新鲜鞣酸溶液混合，置于37°C的水浴锅中1小时后取出，用磷酸缓冲液洗涤3次，2000转/分离心15分钟，制成醛化、鞣化的沉淀红细胞；第四，将步骤三制得的沉淀红细胞加入10倍量0. IM- pH 3 4的醋酸盐缓冲液中， 再与等量纯化山羊痘IgG稀释液混合，置于37°C 2h，其间每隔15min吹吸混勻1次，制得 0. 8% 致敏红细胞悬液；所使用的纯化山羊痘IgG含量控制在1. 5 1. 55mg/mL ；第五，将步骤四制得的致敏红细胞2000转/分离心15分钟，取沉淀红细胞用含0. 1% NaN3、l%新生小牛血清的磷酸缓冲液洗涤5次，最后配成浓度0. 8% 致敏红细胞悬液诊断试剂；第六，分析检测合格即得反向间接血凝诊断试剂。2.—种山羊痘反向间接血本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种山羊痘反向间接血凝诊断试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：第一，无菌采集健康绵羊静脉血，加１０倍量ＰＢＳ，２ ０００转／分离心１５分钟， 洗５遍，以０．１Ｍ－－ｐＨ ７．４～７．８的磷酸缓冲液配成２．５％的红细胞悬液；第二，将步骤一制得的红细胞悬液与１％戊二醛以９：１体积比混合，于室温下缓慢搅拌１ｈ，２０００ 转／分离心１５分钟，用磷酸缓冲液洗５遍，重新制成２．５％的醛化红细胞悬浮液；第三，将步骤二制得的醛化红细胞悬浮液与等量１／２００ ０００新鲜鞣酸溶液混合，置于３７℃的水浴锅中ｌ小时后取出，用磷酸缓冲液洗涤３次，２０００ 转／分离心１５分钟，制成醛化、鞣化的沉淀红细胞；第四，将步骤三制得的沉淀红细胞加入１０倍量０．１Ｍ－－ ｐＨ ３～４的醋酸盐缓冲液中，再与等量纯化山羊痘ＩｇＧ稀释液混合，置于３７℃ ２ｈ，其间每隔１５ｍｉｎ吹吸混匀１次，制得０．８％～１％致敏红细胞悬液；所使用的纯化山羊痘ＩｇＧ含量控制在１．５～１．５５ｍｇ／ｍＬ；第五，将步骤四制得的致敏红细胞２０００转／分离心１５分钟，取沉淀红细胞用含０．１％ＮａＮ３、１％新生小牛血清的磷酸缓冲液洗涤５次，最后配成浓度０．８％～１％致敏红细胞悬液诊断试剂；第六，分析检测合格即得反向间接血凝诊断试剂。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘忠伟，周碧君，程振涛，文明，王开功，嵇辛勤，岳筠，汪德生，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：52
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。