本发明专利技术公开了一种多功能穿梭表达载体及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明专利技术构建的载体pGUGCA以pGAPZB为骨架，以产甘油假丝酵母URA3序列为整合位点，以低浓度Zeocin为大肠杆菌中的筛选标记，以铜离子为酵母筛选标记。本专利获得的穿梭载体pGUGCA可以在大肠杆菌中复制，在产甘油假丝酵母中复制和表达。该载体实现了在大肠杆菌中使用低浓度Zeocin为筛选标记，在酵母中使用铜筛选标记，大大降低了生产和科研成本，同时介导目的基因在产甘油假丝酵母这一优良宿主中进行稳定表达。该发明专利技术为对潮霉素、G418等真菌抗生素都有很强抗性的产甘油假丝酵母提供了方便易得又廉价的转化体系，同时该载体又能应用于酿酒酵母、皱褶假丝酵母等酵母属。为酵母的遗传改造提供了有力工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，特别是一种适用于产甘油假丝酵母的穿梭载体。
技术介绍
产甘油假丝酵母是野生型的甘油高产菌株。与酿酒酵母相比，它具有生长速度和发酵速度快，耐高渗透压，甘油产率高，转化率和耗糖转化率世界领先等较多优势(王正祥，诸葛健.耐高渗压高压甘油的一个假丝酵母新种产甘油假丝酵母.微生物学报.1999,39(001) :68-74)。应用于基因工程技术中的宿主细胞具有较大前景。另一方面， 在大规模生产生物柴油过程中会产生较多的副产物甘油，在一定程度上削弱了发酵法生产甘油的优势，以甘油为原材料或底物生产高附加值的生物产品越来越受到重视，那么以产甘油假丝酵母作为宿主通过代谢工程构建基因工程菌株生产高附加值生物产品具有潜在的前景。但是该菌株的遗传知识和分子生物学信息远远落后于酿酒酵母等模式菌株。该菌株有很多独有的性质，其他酵母适用的载体大多不能在该酵母中使用。如对潮霉素、G418等真菌抗生素具有很强的抗性，不能使用这些抗生素作为遗传工程技术中的筛选标记。遗传转化体系的缺乏已经严重限制了该工业菌株的研究和应用，所以构建适用于该酵母的表达载体迫在眉睫。2008年，本实验室陈献忠(Chen X，Fang H, Rao Ζ, Shen W, Zhuge B，Wang Z and Zhuge J. (2008)An efficient genetic transformation method for glycerol producer Candida glycerinogenes. Microbiol. Res. 163 :531-553)描述了电转化是该菌株的比较合适的转化方法，并且构建了以kocin为筛选标记的整合载体。2010年沈微(Shen W, Wang ZX, Rao ZM, Zhuge J and Zhuge B. (2010)A genetic transformation system based on trpl complementation in C. glycerinogenes. World J. Microbiol. Biotechnol. 27 :1005-1008)构建了基于Trpl互补的以18s rDNA为整合位点的整合载体， 使用的也是^ocin筛选标记。抗药性是最方便的筛选标记，使用药物筛选酵母转化子比使用其他的方法如营养缺陷型，都要简单易行。但是产甘油假丝酵母对潮霉素、G418、放线菌酮等药物的抗性较强，不能使用这些作为筛选酵母转化子的筛选条件。kocin可以用于筛选酵母转化子，但是其价格昂贵，大大限制了对该优良菌株的深入研究。把铜抗性筛选标记应用于产甘油假丝酵母这一工业菌株不仅操作简单，而且大大降低了科研和工业生产成本。
技术实现思路
本专利技术要解决的一个技术问题是提供一种多功能穿梭表达载体，能大大降低生产和科研成本。所述表达载体，以pGAP^为骨架，含有URA3整合位点、多克隆位点、CUPl铜抗性蹄选标记表达盒。所述URA3整合位点5’端有HindIILHpaI酶切位点，能将铜抗性筛选标记表达盒3插入其中。所述多克隆位点包括Asp718I、KpnI、PmlI、&icII、SfiI、XhoI。所述铜抗性筛选标记表达盒包括上游GAP启动子及下游AOXl终止子。所述URA3序列如SEQ ID NO. 1所示。所述铜抗性筛选标记序列如SEQ ID NO. 2所示。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种构建多筛选标记表达载体的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案包括如下步骤1)克隆产甘油假丝酵母的URA3序列到pGAPZB，构建表达载体pGAPZU ；2)克隆酿酒酵母的CUPl序列到pGAPZB，构建载体pGAPZC ；3)以pGAPZC质粒DNA为模板，设计引物扩增酵母筛选标记表达盒，将酵母筛选标记表达盒克隆到pGAPZU的URA3序列5’端HindIILHpaI酶切位点之间，获得pGUGCA穿梭载体。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种产甘油假丝酵母的多筛选标记穿梭载体的应用方法。所述的表达载体URA3序列内部有多个单酶切位点，可使用SspI、BstXI等单酶切线性化转化酵母感受态细胞。所述的表达载体能够在大肠杆菌和产甘油假丝酵母中复制，能够应用于构建产甘油假丝酵母表达体系。所述的表达载体能够应用于克隆目的基因，在大肠杆菌中使用低浓度kocin为筛选标记，在酵母中使用铜筛选标记。所述的表达载体应用于整合表达，能实现目的基因在产甘油假丝酵母中稳定复制和表达。本专利技术提供的表达载体适用于产甘油假丝酵母，能稳定复制、表达，此外还适用于在大肠杆菌中扩增。对于产甘油假丝酵母来说，使用^ocin作为筛选标记的成本为7 元 /L，而使用CuSO4 ·5Η20作为筛选标记的成本仅为1. 1元/L，与之前在酵母中使用kocin为筛选标记相比大大降低了成本，此外本专利克服了大多数抗生素在产甘油假丝酵母无法使用的缺陷。附图说明图1穿梭载体pGUGGA物理图谱。图2转化酵母细胞中绿色荧光蛋白的检测。具体实施例方式本专利技术所用PCR相关试剂，限制性内切酶，CIAP购自TaKaRa公司。质粒小量提取试剂盒和胶回收试剂盒购买自博大泰克。质粒PGAP^购自^witrogen公司，所用分子生物学方法都均按照分子克隆进行操作。实施例1 pT-URA3的构建根据产甘油假丝酵母URA3基因序列(GenBank序列号为No. AY623794)，使用 DNAMAN设计引物URA3U1和URA3R1。为了利于将PCR片段连接到质粒pGAP^上，在上游引物URA3U1的5'端添加BglII酶切位点。下游引物URA3R1的5'端含有BglII酶切位点， 所以不用额外添加BglII酶切位点。上游引物URA3U15' -GAAGATCTGTTCCGCGTATTCTAAGTG-3 ‘，下游引物URA3R15' -GCTTTGGTGGTTTGGTTACCGTGAGG-3 ‘，下划线“_”表示引入的酶切位点。PCR程序为95°C预变性 5min ；94°C变性 50s，55°C退火 2min，72°C延伸 lmin，30 个循环；72°C再延伸IOmin。产物回收后，与T载体连接，转化感受态JM109，使用100ug/mL的 LB平板筛选阳性转化子。提取质粒，验证得质粒构建正确。实施例2 pGAPZU的构建将上述获得的pT-URA3使用BglII进行酶切，于一个500ul的离心管中进行，酶切体系为质粒DNA30ul，10XbufferH 5ul，BglIMul，用水补足50ul。然后放于37°C水浴锅中，酶切证。PGAP^质粒DNA使用同样的酶同样的方法进行酶切。pGAP^质粒酶切产物放于65°C水浴锅中处理半小时，使BglII酶失活，加入CIAP 3ul,CIAP buffer 6ul，然后将离心管放于37°C水浴锅中处理一小时进行去磷酸化，防止酶切片段自连。按8 1的比例往待纯化体系中加入结合缓冲液，充分混勻，混勻后，将溶液加入离心吸附柱中，再将吸附柱套入废液收集管中，8000r/min离心30s。(反应体系不足50 μ 1的，用水补足50 μ 1后再加结合缓冲液)。倒回柱子再离心30s，去废液。在吸附柱内加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多功能穿梭表达载体，其特征是：以ｐＧＡＰＺＢ为骨架，含有多克隆位点、产甘油假丝酵母的ＵＲＡ３序列及铜抗性筛选标记表达盒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛斌，高晓娜，方慧英，诸葛健，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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