本发明专利技术“动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术”的目的在于提供一种应用于农业大学动物医学等专业对动物组织进行石蜡切片的技术。特点是使用化学试剂种类少，无毒害，对组织脱水彻底，加快制片的同时又不使组织过度收缩和硬度增加。替代了对传统石蜡切片制作中对人体有害的二甲苯的使用，消除由此产生的职业病和环境污染。组织由混合固定液(100ml固定液的比例是：85％酒精91ml，甲醛4ml，冰醋酸5ml)固定和梯度酒精脱水后，置入混合透明剂(分析纯正丁醇14％，丙酮29％，无水酒精57％)中，3小时，然后进行常规浸蜡和包埋。切片染色时，用分析纯松节油(60℃)，进行两次脱蜡，常温下行水化，苏木素染核、脱色、兰化及伊红染色。上行脱水到纯酒精后，风干，直接用松节油稀释的树胶封片。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种动物组织石蜡切片的制作方法。
技术介绍
石蜡切片技术是组织学、发育生物学研究的主要实验方法，同时也是病理学中观察病理变化的重要手段，广泛地应用于临床病理诊断、教学和科研工作中。动物标本的形态学观察、免疫组化、原位杂交及原位PCR等技术手段，都离不开标本组织的处理和石蜡切片的制作。常规的组织石蜡切片技术使用二甲苯作为透明剂和脱蜡剂，对组织的收缩性强， 作用迅速，但组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬。二甲苯极易挥发，会对人们的健康造成极大的伤害，可造成操作人员患哮喘，甚至癌症。处理废液时，还会造成空气、水源和食物污染。急需一种或多种代替二甲苯的试剂。有一些资料和文献曾报道过一些替代二甲苯的试剂，但还没有成熟的全套技术， 能像本专利技术一样能够包含最少种类、不含有毒物质和污染物质的化学试剂，来制作动物组织切片。专利和文献资料报道如下专利号为200810136961. X的专利技术专利“生物组织标本常规石蜡制片HE染色无二甲苯全程处理液” [1]，使用了桉油素，四氢呋喃，苯甲酸甲酯，汽油等化学试剂。个别化学试剂对人体和环境有害，如苯甲酸甲酯的缺点属低毒类，吸入、口服或经皮吸收都对身体有害。蒸气或雾对眼和上呼吸道有刺激性，对皮肤有致敏作用。遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧的危险。该物质对环境可能有危害。汽油的缺点易燃。吸入、食入、经皮肤可被人吸收。急性中毒时对中枢神经系统有麻醉作用。当慢性中毒时，会出现神经衰弱综合症、植物神经功能症状类似精神分裂症。 液体吸入呼吸道可引起吸入性肺炎。溅入眼内可致角膜溃疡、穿孔，甚至失明。皮肤接触致急性接触性皮炎，甚至灼伤。谭俊等[2]在组织切片的制作中，使用了松节油。根据本人实验表明，由于透明液只含有单一的松节油，脱水透明效果欠佳。制作方法如下组织在固定液固定60分钟；入80%乙醇，120分钟；入95%乙醇1，90分钟；入 95%乙醇II，60分钟；入95%乙醇III，60分钟；为无水乙醇1，60分钟；为无水乙醇II，60 分钟；TO型生物制片透明剂(主要成分为松节油)1，90分钟；TO型生物制片透明剂11，90 分钟；石蜡3个缸，分别为60分钟；染色时用TO型生物制片透明剂代替二甲苯进行脱蜡。丁伟星[3]和李海等M在组织切片的制作中，使用了正丁醇进行脱水兼透明，但染色时仍使用了二甲苯。其方法如下组织在固定液固定兼脱水1缸，1小时；入I液，为无水乙醇，温度为 65 °C, 40分钟；正丁醇脱水兼透明3缸，每缸约40-60分钟，温度为65°C。专利号为200810136961. X的专利技术专利“生物组织标本常规石蜡制片HE染色无二甲苯全程处理液”中，在脱水时，使用了丙酮和乙醇的混合液，但在透明时，没有再使用丙酮。综上所述，在动物医学专业中，急需一种成熟的全套技术，不含二甲苯，包含最少种类、不含有毒物质和污染物质的化学试剂，来制作动物组织切片。
技术实现思路
用混合固定液(100ml固定液的比例是85%酒精91ml，甲醛細1，冰醋酸5ml)和混合透明剂(分析纯正丁醇14%，丙酮四％，无水酒精57%，常温下按比例混配制)及松节油脱蜡剂代替二甲苯，制作出绿色环保的动物组织切片。具体方法如下1、手工蜡块制作方法如下(1)固定病变组织块置于混合固定液中固定18至M小时(有其它用途的特殊染色除外)(2)脱水 85%乙醇1小时一95%乙醇1小时一95%乙醇1小时一无水乙醇Il 小时一无水乙醇IIl小时(如果用60°C烤箱，时间均为40分钟)(3)透明混合透明剂中3小时(如果用60°C烤箱，时间为2小时)(4)浸蜡石蜡 I (52-54°C )、II (54-56°C )禾口 III (56-58°C )中分别 1 小时(5)包埋(6)修块、切片和烤片2、自动脱水机制作蜡块方法如下(从当日16时到次日8时)(1)固定病变组织块置于混合固定液中固定4小时(有其它用途的特殊染色除外)(2)脱水85%乙醇40分钟一95%乙醇40分钟一95%乙醇40分钟一无水乙醇 140分钟一无水乙醇1140分钟(3小时20分)(3)透明混合透明剂中2小时(4)浸蜡石蜡 I (52-54°C ) 2 小时、II (54-56°C ) 3 小时和 III (56-58°C )中分别 2小时40分(5)包埋、修块、切片和烤片3、HE染色，用松节油替代二甲苯，时间上比传统长(二甲苯脱蜡2-5分钟，而松节油 脱蜡20-30分钟，且在60°C烤箱中进行)(1)脱蜡至水松节油120-30分钟(在60°C烤箱中进行)一松节油1120-30分钟 (在60°C烤箱中进行)一无水乙醇Il分钟一无水乙醇IIl分钟一95%乙醇1分钟一80% 乙醇1分钟一70%乙醇1分钟一自来水洗2分钟(2)染色Harris苏木素液20分钟一自来水洗5分钟一1 %盐酸乙醇分化30秒一自来水洗一饱和碳酸锂30秒一自来水水1分钟一伊红10分钟(3)脱水、透明和封固 75%乙醇20秒一80%乙醇40秒一90%乙醇1分钟一无水乙醇Il分钟一无水乙醇IIl分钟一风干后，直接用松节油稀释的中性树胶封固。具体实施例方式以下通过几个实施例对本专利技术的效果进行说明。实施例1 猪蓝耳病的病理学观察选择有代表性的病猪的各个病变器官组织块，当日下午16点置于混合固定液中。次日上午8点，组织入85 %乙醇1小时。9点，组织入95 %乙醇1小时。10点，组织入95 %乙醇1小时11点，组织入无水乙醇11小时12点，组织入无水乙醇IIl小时(如果用60°C烤箱，以上脱水时间均为40分钟)13点，组织入混合透明剂中3小时(如果用60°C烤箱，时间为2小时)16点，组织入52_54°C熔点的石蜡I中1小时(在60°C烤箱中进行)17点，组织入M_56°C熔点的石蜡II中1小时(在60°C烤箱中进行)18点，组织入56_58°C熔点的石蜡III中1小时(在60°C烤箱中进行)19点，进行包埋至此，蜡块做好。切片时，放入冰箱冷冻层冻1小时后，取出可以进行常规切片。切片进行染色的具体步骤如下(1)脱蜡至水松节油120-30分钟(在60°C烤箱中进行)一松节油1120-30分钟 (在60°C烤箱中进行)一无水乙醇Il分钟一无水乙醇IIl分钟一95%乙醇1分钟一80% 乙醇1分钟一70%乙醇1分钟一自来水洗2分钟(2)染色Harris苏木素液20分钟一自来水洗5分钟一1 %盐酸乙醇分化30秒一自来水洗一饱和碳酸锂30秒一自来水1分钟一伊红10分钟(3)脱水、透明和封固入75%乙醇20秒一80%乙醇40秒一90%乙醇1分钟一无水乙醇Il分钟一无水乙醇IIl分钟一风干后，直接用松节油稀释的中性树胶封固。以下为本病例的病理组织学观察结果。肺脏部分区实变，部分肺泡扩张破裂，部分肺泡内有淋巴细胞、红细胞、组织细胞渗出，扩张的肺泡中有脱落的肺泡上皮组织细胞，肺泡毛细血管扩张充血。肺间质可见淋巴细胞、组织细胞呈小灶状分布。肝脏肝小梁间质增宽，小血管扩张充血，间质有淋巴细胞、组织细胞渗出，肝血窦扩张，窦内淋巴细胞肥大、增生，肝细胞体积增大。肾脏肾小球毛细血管扩张、充血，间质水肿，组织细胞形成小结，有散在淋巴细胞，肾小管上皮细胞颗粒变性，肾脏中有脱落的肾小管上皮细胞。脾脏脾动脉淋巴鞘变本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术，其特征在于：使用简单环保化学试剂，制作动物组织石蜡切片，减少试剂种类的适应，减少试剂对人体和环境的危害，且易于推广。具体分为组织脱水和切片染色两部分。（１）组织脱水混合固定液：１００ｍｌ固定液的比例是：８５％酒精９１ｍｌ，甲醛４ｍｌ，冰醋酸５ｍｌ。混合透明剂：用分析纯正丁醇１４％，丙酮２９％，无水酒精５７％，常温下按比例混配。（２）切片染色切片脱蜡液Ｉ：用分析纯松节油，６０℃烤箱中进行。切片脱蜡液ＩＩ：用分析纯松节油，６０℃烤箱中进行。用伊红染色后，梯度酒精脱水后，自然风干，直接用松节油稀释的树胶封片。
【技术特征摘要】
1.动物组织石蜡切片的绿色环保制作技术，其特征在于使用简单环保化学试剂，制作动物组织石蜡切片，减少试剂种类的适应，减少试剂对人体和环境的危害，且易于推广。具体分为组织脱水和切片染色两部分。(1)组织脱水混合固定液100ml固定液的比例是85%酒精91ml，甲醛細1，冰醋酸5ml。混合透明剂用分析纯正丁醇14%，丙酮，无水酒精57%，常温下按比例混配。(2)切片染色切片脱蜡液I 用分析纯松节油，60°C烤箱中进行。切片脱蜡液II 用分析纯松节油，60°C烤箱中进行。用伊红染色后，梯度酒精脱水后，自然风干，直接用松节油稀释的树胶封片。2.在整个蜡块制作和切片染色过程中，没有使用传统的透明和脱蜡剂二甲苯，使用的试剂，不对人体和环境产生危害作用。3.根据权利1和2的要求，动物组织取材后，放入混合固定液中，18-M小时后，经梯度...
【专利技术属性】
技术研发人员：范春玲，周玉龙，任亚超，郭婷，齐欣，兰明慧，孙斌，郭东华，吴海燕，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：23
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