本发明专利技术提供了一种金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明专利技术融合蛋白的制备方法包括金黄色葡萄球菌IsdB免疫优势片段(IsdB?immunodominant?fragment，IsdBid)的选择和采用重叠引物延伸PCR技术将IsdBid与trap基因用Linker连接起来，并将IsdBid-TRAP融合蛋白基因进行原核表达，然后纯化该融合蛋白。利用本发明专利技术的IsdBid-TRAP融合蛋白制备得到的疫苗免疫小鼠后，经检测该融合蛋白疫苗的免疫效果明显优于IsdB和TRAP单独免疫以及IsdB与TRAP混合在一起免疫的免疫效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白制备方法及其应用。
技术介绍
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus, S. aureus)是一种革兰氏阳性菌，既是引起人类多种感染的主要病原菌，也是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。但随着临床上抗生素在S. aureus感染治疗中的普遍使用，已出现了大量S. aureus耐药菌株，致使抗生素治疗收效甚微，甚至毫无效果。因此，对S. aureus感染的免疫预防和免疫治疗成为研究的焦点。 在过去的40多年中，人们对S. aureus全菌灭活苗、荚膜多糖结合苗、类毒素、菌体表面粘附素以及菌体结构蛋白亚单位苗等作了大量研究，但免疫保护效果都不令人满意。近年来，随着人们对S. aureus认识的不断深入和对S. aureus苗的研究探索，人们逐渐意识到使用单一抗原分子作为免疫原进行免疫，其所提供的免疫保护作用有限。而使用S. aureus两种以上抗原制成疫苗会使免疫保护作用得到进一步提高。Isd 是 S. aureus 铁调节表面决定簇 Qron-regulated surfacedeterminant)的缩写，包括IsdB、IsdA、IsdH等多个成分。Kuklin等报导，Isd家族成员——IsdB在各种S. aureus株中高度保守，将表达的IsdB用硫羟磷酸铝佐剂制备免疫原免疫小鼠，证实该苗具有高度的免疫原性，能显著降低金黄色葡萄球菌对小鼠的致死率。TRAPCTargetof RNAIII Activating Protein)是一个由167个氨基酸残基组成的蛋白质，在葡萄球菌中高度保守。它能够被RNAIII激活蛋白(RAP)激活，而且研究认为TRAP在葡萄球菌应激反应中发挥作用，可保护DNA免受氧化损伤、自然突变和适应性突变的影响。本专利技术人曾对表达的IsdB、TRAP和RAP的免疫保护作用进行了比较研究，结果IsdB、TRAP和RAP均能够刺激小鼠产生良好的体液免疫应答和高水平的细胞因子(IL-4、IFN-Y)，在小鼠败血症模型中用不同菌株攻毒，其免疫保护效果TRAP略优于IsdB，IsdB略优于RAP。到目前为止，有关 IsdB与TRAP融合蛋白的免疫原性和免疫保护作用未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白及其制备方法。本专利技术的另一目的是提供上述IsdBid-TRAP融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白，其是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的IsdB免疫优势片段(IsdB immunodominant fragment, IsdBid)和TRAP融合而成。该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第 246位的N替换为H，不会影响融合蛋白的抗原性。本专利技术还提供编码上述融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。本专利技术还提供含有上述基因的载体以及含有该载体的宿主细胞。本专利技术还提供上述金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白的制备方法，其是将编码上述金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白的基因克隆至原核细胞中进行异源表达，并纯化该融合蛋白。本专利技术的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。首先以金黄色葡萄球菌基因组为模板，通过PCR方法扩增获得IsdB和TRAP的基因，然后通过生物信息学分析将IsdB分为3个片段，并通过免疫原性分析和免疫保护作用研究，选择和确定了 IsdB免疫优势区(IsdBid)。在此基础上，设计引物，通过重叠延伸PCR 方法扩增获得IsdBit^P Trap的融合基因，并将该基因插入到表达载体pET_32a，转化大肠杆菌，经IPTG诱导后可获得高水平表达的可溶性融合蛋白ISdBid-Trap。本专利技术进一步提供上述融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。具体为 利用该融合蛋白N末端含有的6个连续His残基能与Ni2+柱结合的特性，选用MagneHisTM 蛋白纯化系统进行纯化，并将纯化后的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备疫苗免疫动物，然后进行抗体和细胞因子水平检测以及采用不同菌株攻毒。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果采用本专利技术的IsdBid-TRAP融合蛋白制得的疫苗免疫小鼠后，检测体液和细胞免疫应答水平，并进行攻毒，结果证实该融合蛋白疫苗的免疫效果明显优于IsdB和TRAP单独免疫以及IsdB与TRAP混合在一起免疫的免疫效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本专利技术的融合蛋白具有更好的免疫原性及免疫保护作用。另外，本专利技术的 IsdBid-TRAP融合蛋白不但进一步提高了抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用，而且简化了制备过程，在新型疫苗的开发应用方面具有重要的价值。附图说明图1为isdBl、isdB2和isdB3基因的PCR扩增产物的电泳分析结果。其中，M: DL2000DNA Marker,大小从上到下依次为 5000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp,IOObp ；1 isdBl(738bp) ；2 :isdB2(795bp) ；3 :IsdB3 (675bp)。图2为PCR产物回收纯化电泳结果。其中，M :DL2000 DNAMarker ；A :isdBl基因； B :isdB2 基因；C :isdB3 基因。图 3 为重组质粒 pMD18T-isdBl、pMD18T_isdB2、pMD18T_isdB3 的 PCR 及双酶切鉴定结果。其中，M:DL2000 DNA Marker ;A isdBl 基因 PCR 产物；B :pMD18T_isdBl 双酶切产物；C :isdB2基因PCR产物；D :pMD18T_isdB2双酶切产物；E :isdB3基因PCR产物；F pMD18T-isdB3双酶切产物。图 4 为 pET-32a 与 isdBl、isdB2、isdB3 片段纯化回收结果。其中，M :DL2000 DNA Marker ；1 :pET_32a 片段；2 :isdBl 基因；3 :isdB2 基因；4 :isdB3 基因。图5为重组质粒pET-isdBl、pET_isdB2、pET_isdB3的PCR及双酶切鉴定结果。 其中，M :DL2000 DNA Marker ； 1-3 isdBl、isdB2 和 isdB3 基因 PCR 产物；4-6 :pET_isdBl、 pET-isdB2 和 pET_isdB3 双酶切产物。图6为重组IsdBl蛋白表达及纯化的SDS-PAGE电泳结果。其中，M 蛋白Marker， 大小从上到下依次为 116. OkDa,66. 2KDa、45. OkDa,35. OkDa,25. 0kDa、18. 4kDa、14. 4kDa ；1 未诱导的重组菌；2-4 依次为IPTG诱导2、3和4h的重组菌；5 =IsdBl蛋白纯化结果。图7为重组IsdB2蛋白表达及纯化的SD本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．金黄色葡萄球菌ＩｓｄＢｉｄ－ＴＲＡＰ融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白的氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔玉东，朱战波，王宁，马金柱，迟佳琦，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：23
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