生物样品的玻璃化方法技术

本发明专利技术涉及生物样品玻璃化的方法。根据本发明专利技术的方法，使生物样品与冷冻物质直接接触。接触该冷冻物质时，该生物样品发生玻璃化。已发生玻璃化的物质可以贮存一段时间，以后再复苏。复苏后的生物样品依然存活。根据本发明专利技术优选的生物样品是发育细胞。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

Vitrification method for biological sample

The invention relates to a method for vitrification of biological samples. According to the method of the invention, the biological sample is directly contacted with the frozen substance. When contacting the frozen material, the biological sample is glass. A glassy substance can be stored for a period of time and then recover. After resuscitation, the biological samples are still alive. The preferred biological sample according to the present invention is the developmental cell.

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物样品玻璃化的方法，这样在复苏后该生物样品依然存活。
技术介绍
能够冷冻保存卵母细胞、胚胎、精子和其它类似的生物样品，对广泛应用辅助生殖技术是非常关键的。但是，由于这些细胞体积大且卵母细胞和早期胚胎对低温非常敏感，冷冻技术在多数种类中没有得到好好发展。传统上，用“缓慢冷冻技术”冷冻保存胚胎。低浓度冷冻保护剂和缓慢控制的冷冻速度(一般在0.1℃-0.3℃/分钟间)使细胞在冷冻过程中缓慢脱水从而防止细胞内形成结晶。基于此，用此种方法冷冻保存卵母细胞、胚胎和其它发育细胞导致转移后其致孕能力和保孕能力下降。卵母细胞对冷冻保存损伤尤其敏感，因为冷冻期间其中期纺锤体微管的完整性受到破坏。另一种更重要的冷冻方法依赖于用高浓度冷冻保护剂所形成的玻璃化，迅速冷却该保护剂时导致玻璃样状态形成。然而，该玻璃化技术的缺点在于此类冷冻保护剂对卵母细胞、胚胎和其它脆弱的发育细胞有很大毒性。可通过提高冷冻速率使冷冻保护剂的毒性缩至最小，快速冷冻可通过将位于电镜格栅或薄壁吸管(straw)(开口的拉伸的吸管)中的卵母细胞直接投放到液氮内来完成。然而，这两种方法都很麻烦，且胚胎的恢复很成问题。因此仍需要使生物样品玻璃化的方法，该方法(应)能使样品细胞的冷冻速率达最大；在玻璃化和以后的复苏期间保持该样品的存活，避免样品遭受机械压力；并提供简易操作来进行冷冻保存和复苏。专利技术概述本专利技术涉及生物样品玻璃化的方法。根据本专利技术的方法，使生物样品直接与冷冻物质接触。接触该冷冻物质时，该生物样品发生玻璃化。已发生玻璃化的生物样品可贮存一段时间，以后再复苏。复苏后的生物样品仍存活。根据本专利技术优选的生物样品是可发育的细胞。本专利技术也涉及生物样品玻璃化的方法，包括应用转移工具将该生物样品置于冷冻物质比如液氮中，这样使该生物样品直接接触该冷冻物质。然后该生物样品在该转移工具中发生玻璃化，优选转移工具是套环。再优选使该转移工具和生物样品置于冷冻物质内并转移到含冷冻物质的容器中。该容器优选是小瓶。然后使含有该冷冻物质、套环和玻璃化生物样品的小瓶密封并冷冻保存直至再需要此生物样品之时。本专利技术另一方面是在玻璃化之前在冷冻保护剂中处理该生物样品。本专利技术还涉及已发生玻璃化之生物样品的复苏方法。该复苏方法学包括从其得以冷冻保存的冷冻物质中取出该生物样品并将该生物样品置于温暖的复苏溶液中。该复苏溶液可存在于任何恰当的容器中，优选存在于培养皿或吸管内。本专利技术还有一方面是发育细胞玻璃化的方法，其中将一或多个发育细胞直接置于冷冻物质中，这样每个发育细胞直接接触该冷冻物质并因此发生玻璃化，其中该发生玻璃化的发育细胞在复苏、培养和移植到恰当的宿主有机体中时受精率与未发生玻璃化的同样的发育细胞相同。优选地，将该发育细胞置于套环内与冷冻物质接触。本专利技术还涉及哺乳类囊胚或哺乳类分裂期胚胎发生玻璃化的方法，包括将一或多个囊胚或分裂期胚胎直接置于冷冻物质中，这样每一囊胚直接与该冷冻物质相接触并因此发生玻璃化，其中至少80％，更优选地，90％玻璃化的囊胚或分裂期胚胎在复苏并，优选在合适的基础培养基中培养后依然存活。优选地，将该囊胚或分裂期胚胎置于套环内与冷冻物质接触。本专利技术还涉及马胚胎或猪胚胎玻璃化的方法，包括将一或多个胚胎直接置于冷冻物质中，这样每个胚胎直接与冷冻物质相接触并因此发生玻璃化，其中至少25％，更优选地，50％玻璃化胚胎在复苏并，优选在合适的基础培养基中培养后依然存活。优选将该胚胎置于套环中与冷冻物质接触。本专利技术还涉及生物样品玻璃化的试剂盒。该试剂盒一般含有叙述生物样品玻璃化(方法)的说明书，其中将生物样品直接与冷冻物质相接触。该试剂盒也包括一种或多种可选成分，包括但不限于，转移工具，更优选套环、有合适的大小和形状以便容纳该套环和其中的玻璃化样品的小瓶、基础培养基、转移溶液和冷冻保护剂。本专利技术还涉及通过本专利技术的方法发生玻璃化的生物样品。附图简述附图说明图1为根据本专利技术生物样品玻璃化方法的图解说明。详述本申请中，全文使用以下术语并根据申请目的定义如下基础培养基为培养、操作、运输或贮存此处的生物样品而特定生产的固体或液体制品。冷冻保存在极低温度下对生物样品的保存。可发育细胞有机体的生殖体，具有发育成能够独立存在的新有机体个体的能力。可发育细胞包括，但不限于，精子、卵母细胞、胚胎、桑葚胚、囊胚或其它早期胚胎细胞。直接接触若生物样品或含有该生物样品的培养基、溶液或物质的大多数表面与冷冻物质直接接触的话，则该生物样品，包括囊胚和胚胎，与该冷冻物质“直接接触”。冷冻物质任何能够使生物物质发生玻璃化的物质，包括但不限于，液体气体如液氮、液丙烷、液氦或乙烷半融物(slush)。套环小生物样本的操作工具，一般由一持有一块尼龙或金属丝如白金或镍钢等的竿状柄组成，该尼龙或金属丝在其游离端形成一个闭环。转移工具用来操作生物样品使之进入冷冻物质的工具，玻璃化期间其环绕和/或容纳该生物样品和/或含有该生物样品的培养基、溶液或物质，使之维持在原位，并且/或者便于在该冷冻物质中轻松操作该生物样品，其中该转移工具使该生物样品与该冷冻物质直接接触。该转移工具可以是本领域一般知晓的任何此类工具，包括但不限于，套环、带柄的网或带柄的桨。此处定义的术语“转移工具”不包括电镜格栅或吸管(包括密封和开口的拉伸的吸管)。存活的能生存并正常发育一段时间的生物样品。玻璃化(使玻璃化)一种现象，其中使生物样品迅速冷却至极低温度，这样样品内的水未经结晶而形成玻璃样状态。本专利技术在美国临时专利申请第60/104,266号的基础上，指生物样品玻璃化的方法，该专利全文在此引入供参考。根据本专利技术的方法，将生物样品直接置于冷冻物质中这样该生物样品与该冷冻物质直接接触。接触该冷冻物质时，该生物样品发生玻璃化。已发生玻璃化的生物样品可贮存一段时间，以后再复苏。复苏的生物样品依然存活。因此本专利技术用途广泛。其可用于畜牧业、实验室研究、濒危物种保护以及人类辅助生殖。本专利技术的生物样品可以是任一种活细胞生物样品，但优选发育细胞，更优选哺乳类发育细胞。此类细胞包括，但不限于，精子、胚胎、囊胚、桑葚胚和卵母细胞。此类优选细胞可来自任何所需的哺乳动物包括但不限于人类；非人类灵长类比如猴；实验动物比如大鼠、小鼠和仓鼠；农业家畜如猪、绵羊、牛、山羊和马；和有重要的动物学意义的和/或濒危动物等等。本专利技术范围也包括使用其它活生物体来源的其它发育细胞，比如爬行动物、两栖动物和昆虫比如果蝇属。本专利技术使用的其它合适的细胞包括干细胞，包括人干细胞，和植物组织细胞。以下实施例用许多不同类型的细胞说明本专利技术的用途，包括仓鼠胚胎，该胚胎对损伤极为敏感，因此成为任何冷冻技术的良好模型。这些实施例也表明本专利技术对牛卵母细胞和胚胎很有效，本领域技术人员知晓后者对冷冻损伤极为敏感。优选地，在玻璃化前将该生物样品置于转移工具上。该转移工具可以是将该生物样品运送到冷冻物质中的任何工具，从而使该生物样品与该冷冻物质直接接触，使该生物样品迅速冷却，因此使该生物样品玻璃化而非在细胞内形成冰晶，后者反过来最终破坏细胞壁和其它重要的细胞成分。本专利技术的方法有别于现有领域以前的方法，其中生物样品是包含在容器比如封闭的吸管或拉开的吸管中，而不是与冷冻物质直接接触。另外，本方法学有别于现有领域以前的本文档来自技高网...

【技术保护点】
生物样品的玻璃化方法，包括： （ａ）将该生物样品置于转移工具上； （ｂ）将该转移工具和该生物样品直接放进冷冻物质中，其中生物样品直接与该冷冻物质接触从而发生玻璃化，并且其中该生物样品在其复苏后将是有生存能力的。

【技术特征摘要】
US 1998-10-14 60/104,2661.生物样品的玻璃化方法，包括(a)将该生物样品置于转移工具上；(b)将该转移工具和该生物样品直接放进冷冻物质中，其中生物样品直接与该冷冻物质接触从而发生玻璃化，并且其中该生物样品在其复苏后将是有生存能力的。2.权利要求1的方法，其中该生物样品选自胚胎、精子、卵母细胞、囊胚和桑葚胚。3.权利要求1的方法，其中该转移工具选自套环、网和桨。4.权利要求1的方法，其中(a)还包括(i)在玻璃化之前用冷冻保护剂处理该生物样品。5.权利要求1的方法，还包括(c)已发生玻璃化的该生物样品的复苏。6.权利要求1的方法，其中(b)还包括(i)将已行玻璃化的该生物样品转移进贮藏容器中，该贮藏容器含有冷冻物质；和(ii)贮藏含有已行玻璃化的该生物样品的贮藏容器直至该生物样品待复苏。7.权利要求5的方法，其中(c)还包括(i)从冷冻物质中将生物样品取出；和(ii)将生物样品放于复苏液中。8.权利要求7的方法，其中该复苏液放于培养皿中。9.权利要求7的方法，其中复苏液放在吸管中。10.权利要求1的方法，其中(a)还包括(i)将该生物样品放在基础培养基中，其中该生物样品选自胚胎、卵母细胞、精子、囊胚和桑葚胚，其中转移工具选自套环、网和桨；并且其中(b)还包括(i)将含有该生物样品的转移工具放进冷冻物质中，其中该冷冻物质装在容器中，以便生物样品发生玻璃化和；(ii)密封含有冷冻物质、转移工具和生物样品的容器。11.权利要求10的方法，其中该基础培养基包含一种或多种选自冷冻保护剂和粘度增加化合物的成分。12.权利要求10的方法，还包括(c)将已行玻璃化的该生物样品复苏。13.权利要求12的方法，其中(c)还包括(i)将该生物样品从该冷冻物质中取出；和(ii)将该生物样品放进复苏液中。14.权利要求12的方法，其中该复苏液放在培养皿中。15.权利要求12的方法，其中该复苏液装于吸管中。16.通过权利要求1的方法所产生的已发生玻璃化的生物样品。17.通过权利要求11的方法所产生的已玻璃化的生物样品。18.生物样品玻璃化方法，包括(a)将该生物样品放进基础培养基中，其中该生物样品选自胚胎、卵母细胞、精子、囊胚和桑葚胚；(b)应用转移工具将该生物样品移至装在容器中的冷冻物...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡特里娜T福雷斯特，米歇尔T莱恩，
申请(专利权)人：卡特里娜T福雷斯特，米歇尔T莱恩，
类型：发明
国别省市：US[美国]