一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记，属于作物育种学领域。前期研究中获得一个具有57H前体聚增的低谷蛋白隐性突变体冷水糯，根据突变位点两侧的序列设计了CAPS标记DG-2，通过检测两个亲本、杂交F1代及性状稳定的高代品系，结合SDS-PAGE蛋白电泳结果，证实该标记可以准确地区分具有57H前体聚增的低谷蛋白水稻材料，同时，该标记可以区分突变基因的杂合型，可以用于分子标记辅助选择育种。这项发明专利技术对于筛选和培育低谷蛋白水稻品种，满足特殊人群的需求具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记，根据具有57H前体聚增的低谷蛋白水稻地方品种冷水糯的WopJ基因的突变位点，设计了用于特异检测具有57H前体聚增的低谷蛋白性状的CAPS标记(DG-2)，可以直接区分杂合和纯合基因型。在育种和资源创新过程中，可以直接利用DG-2选择自己所需的基因型， 减少种育种盲目性和田间工作量，属于生物
技术介绍
近年来，随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变，出现了肾脏病患者和糖尿病肾病患者不断增加的倾向。据最新统计，全球有超过5亿人患肾病，在中国，慢性肾病的患病率约为10%，大约有1.2亿人。上述人群由于肾功能出现障碍，必需进行适当的蛋白摄入限制，不能食用可吸收蛋白含量高的稻米，患者只能进食代用品或改变饮食结构以降低吸收蛋白的摄入量(Mochizukiet al. , 2000) 0因此，培育适应蛋白摄入被限制的肾脏病人需要的谷蛋白含量低的水稻品种已成为一个新的水稻育种目标。水稻是我国第一大粮食作物。作为水稻种子主要贮藏蛋白的谷蛋白(约占胚乳总蛋白的60% 80%)是大米中能为人体消化吸收的主要蛋白成分。水稻谷蛋白以蛋白体的形式贮存于胚乳中(Mimtz K, 1998)。谷蛋白的合成首先合成分子量约为57KD的前体，经过穿膜、剪切和酶解等一系列目前还不甚清楚的复杂过程最终形成成熟谷蛋白，包括37 39KD的酸性亚基(具酸性等电点)和22 23KD的碱性亚基(具碱性等电点)(牛洪斌等，2007;Qu LQ et al.)。低谷蛋白水稻包括两种类型，一类是以水稻品种LGC-I为代表的无57KD前体聚增类型，另外一类是具有57KD前体聚增(57H)伴有成熟亚基减少的类型(Kusaba et al. , 2003 ； Fukuoka et al. , 1996； Kumamaru et al.,1988； Satoh et al., 1994; Satoh et al., 1995;江绍玫等，2003)。水稻谷蛋白基因属于多基因家族，到目前为止，至少已克隆到10个谷蛋白基因。根据这些基因序列的相似性可将其分为GluA和 GluB两个亚家族，亚族内基因间碱基相似性达到80%以上，亚族间同源性在60%左右。日本在第一类水稻低谷蛋白的理论及应用方面的研究处于世界领先。日本科学家通过化学诱变结合全蛋白SDS-PAGE电泳筛选，获得了低谷蛋白突变体材料NM67。 它与原始亲本“日本优”回交，获得改良农艺性状的LGC-1，并对该品种低谷蛋白性状的突变机理进行研究，明确该性状是由于功能基因GluB4和GluB5之间缺失一段染色体片段。 LGC-I作为肾脏病、糖尿病人专用的水稻品种于1994年起试种，次年应用于临床，效果显著。该品种受到日本各大医院以及肾脏病和糖尿病患者的普遍欢迎，并获日本育种学会奖。利用NM67还育成了 Mikai 231 (西海231)等低谷蛋白品种。万建民等用LGC-I与日本主栽水稻品种越光杂交、回交，在国内首次也是唯一成功育成了含有低谷蛋白基因的水稻新品种W3660。对于第二类水稻低谷蛋白的研究还处于理论研究及资源的筛选和创造方面。 Kumamaru等从MNU诱导的突变株系材料中，筛选到了 6个57H突变体，其中有3个57H突变体分别受互不等位的单基因位点M/^ ,glupl和WopJ 的控制。除了诱变材料之外，在天然材料中同样发现了不少57H突变体。Satoh等从来自俄罗斯、中国北部和朝鲜的1400 个材料中发现了 19个57H天然突变株系，经SDS-PAGE电泳显示，其57kDa条带量增加而成熟亚基量减少。江绍玫等从来自中国云南、贵州等16个地区的160余份资源中筛选得到57H突变体材料W379。理论研究方面，至少有8个控制57H表型的基因被报道，包括 esp2,glupl {esp5) ,glup2 (esp6) ,glup3 {esp7) ,glup4 {esp8) ’glup5,glup6 禾口其中 WopJ的主要功能是裂解谷蛋白的前聚体为两类成熟亚基(Kumamaru et al.,2007; Wang et al.，2009)。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是为了加速已经筛选出的具有57H前体聚增低谷蛋白水稻地方资源在育种中的有效利用，设计与低谷蛋白性状连锁的分子标记，通过检测分子标记，可以预测杂交后代的低谷蛋白性状，在苗期就可鉴定出低谷蛋白水稻单株，避免了繁琐的谷蛋白含量测定，提高鉴定效率，节约成本。技术方案一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记方法，其特征在于使用分子标记DG-1，其引物序列为 DG-IF :ACTGTGCTTGTGCTGTGGTC DG-IR GGCTATCGGAGCAGCACTAC以水稻基因组DNA为模板，该标记如果能扩增出4795bp的条带，则该水稻基因组DNA 中含有与水稻57H蛋白前体裂解有关基因GluP3，该4795bp条带含有与水稻57H蛋白前体裂解有关基因全长。一个与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记方法，其特征在于使用分子标记DG-2，其标记引物为DG-2F TGGGGAACATACTGCCCTGGGG DG-2R :AGGCATACCTGTGACACACCGA以水稻基因组DNA为模板扩增，产物运用TscAI酶进行酶切，来自于具有57H前体聚增的低谷蛋白品种冷水糯的片段为17!3bp的条带，该条带具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白基因部分序列；来自于常规水稻品种的片段被切成105bp和68bp的两条片段。使用所述分子标记DG-2扩增以冷水糯为亲本的后代植株DNA，产物运用TscAI酶进行酶切，如果出现17;3bp、105bp和68bp的三条片段，则该以冷水糯为亲本的后代植株中 WopJ基因为杂合型。有益效果1.本专利技术获得与具有57H前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记。在前期研究中获得一个低谷蛋白隐性突变体冷水糯，该突变体籽粒的谷蛋白具有 57KD前体聚增(57H)伴有成熟亚基减少。由于基因与57H前体裂解相关，本研究对冷水糯的测序、比对后，发现冷水糯的WopJ基因的编码区第拟4个碱基由G突变为 A(图1)，导致翻译产物第275个氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺。根据突变位点两侧的序列设计了 CAPS标记DG-2，该标记能扩增出173bp的条带，运用TscAI酶对该片段进行酶切，来自于冷水糯的片段不能被该酶切开，来自于9311的片段可被切成105bp和68bp的两条片段，而来自于9311/冷水糯的杂交1代PCR产物经酶切后，出现双亲的带型(图2)。该标记对9311/冷水糯的高代品系(F7代)的100个家系进行鉴定，结合SDS-PAGE蛋白电泳结果， 证实该标记可以准确地区分具有57H前体聚增的低谷蛋白水稻材料(图3)，同时，该标记可以区分^Aza 基因的杂合型，可以用于分子标记辅助选择育种。2、鉴定方便、准确，节约成本，提高选择鉴定效率。在传统的低谷蛋白性状选育中，首先要将具有低谷蛋白性状基因的亲本与优良的栽培品种进行杂交，在分离世代中选择大量的农艺性状优良的单株，进行单株籽粒谷蛋白含量测定，工作量大，繁琐。而运用该标记检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一个与具有５７Ｈ前体聚增的水稻低谷蛋白性状连锁的分子标记方法，其特征在于：使用分子标记ＤＧ－１，其引物序列为：ＤＧ－１Ｆ：ＡＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＤＧ－１Ｒ：ＧＧＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣ以水稻基因组ＤＮＡ为模板，该标记如果能扩增出４７９５ｂｐ的条带，则该水稻基因组ＤＮＡ中含有与水稻５７Ｈ蛋白前体裂解有关基因Ｇｌｕｐ３，该４７９５ｂｐ条带含有与水稻５７Ｈ蛋白前体裂解有关基因Ｇｌｕｐ３全长。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方先文，罗楚平，张所兵，林静，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84
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