本发明专利技术公开了草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因、编码的重组蛋白及其时空表达图谱的构建方法和用途。本发明专利技术草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。该核苷酸序列编码的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。将本发明专利技术的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因在草鱼组织和发育过程中的表达，该基因在血液、中肾、头肾、脾、鳃、肠、心中大量转录，在脑、肌、肝、皮中有微量转录，在鳍条中检测到及其微量mRNA的存在。该基因从尾鳍期开始大量转录，在鱼苗3天达到最大表达量。本发明专利技术还公开了草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因、编码的重组蛋白在草鱼育苗和作为草鱼饲料添加剂中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生命科学
，尤其涉及草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (grass carp Tissue inhibitor of metalloproteinases-2，gcTIMP-2)基因、编码的重组蛋白及其时空表达的构建方法，本专利技术还涉及草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (grass carp Tissue inhibitor ofmetalloproteinases-2, gcTIMP-2)基因的用途。
技术介绍
草鱼是一种草食性鱼类，饲养成本低，养殖地域广，是我国淡水养殖的主要品种， 其产量约占淡水养殖总产量的20%。但草鱼病害多，而其中以草鱼出血病最甚，给养殖业带来巨大的损失。目前水生动物暴发性出血病病因现已基本查明，其代表菌株为嗜水气单胞菌。因此对于嗜水气单胞菌所产生毒素的抑制成为一个主要的研究方向。基质金属蛋白酶抑制因子-2(Tissue inhibitor ofmetalloproteinases-2, TIMP-2)是基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase 2，mmp-2)的天然抑制物，是一组能抑制基质金属蛋白酶-2的多功能因子。而基质金属蛋白酶-2作为一种作用范围最广的基质金属蛋白酶近来受到越来越多的关注，同时其也是嗜水气单胞菌最重要的致病因子之一。TIMP-2的主要功能是对基质金属蛋白酶的抑制作用，调节细胞外基质的代谢；同时还在细胞生长、繁殖及刺激血管生成等生理和病理学方面发挥一定的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种可作为基因工程疫苗的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP-2)基因。本专利技术另一目的在于提供上述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因编码的重组蛋白。本专利技术的另一目的在于提供上述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因时空表达图谱的构建方法。本专利技术的另一目的在于上述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因及其编码的重组蛋白的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现本专利技术依据已有的草鱼头肾cDNA文库中所挑选的TIMP-2EST序列为基础，采用 RACE法克隆得到该草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因的编码区序列及5’端非编码区序列。本专利技术通过对以上草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP-2)基因进行序列测定，得到草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP-2)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO=I 所示，并通过基因工程方法表达出重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本专利技术的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因一种典型的基质金属蛋白酶抑制剂，由218个氨基酸组成，含有12个高度保守的半胱氨酸残基，形成6个二硫键的环状结构，每3个环状结构形成1个结构域，N末端3个环状结构较大，可与mmps的活性中心结合，抑制mmps活性；C末端3个环状结构较小与抑制mmps无关，但参与timps的其他功能。本专利技术的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因的时空表达图谱的构建方法是根据获得的cDNA序列设计RT-PCR引物，检测gcTIMP-2基因在草鱼组织和发育过程中的表达情况，考察了其在草鱼血液、中肾、头肾、脾脏、鳃、肠、心脏、脑、肌肉、肝脏、表皮、鳍条的mRNA水平，考察了其在受精卵、0phf、16cell、桑椹期、原肠期、眼基期、尾鳍出现期、肌肉效应期、心跳期及受精后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天和15天的表达图谱。本专利技术的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因可用于草鱼的人工育田ο本专利技术的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因可用于制备草鱼的饲料添加剂。本专利技术的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因编码的重组蛋白可用于草鱼的人工育苗。本专利技术的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因编码的重组蛋白可用于制备草鱼的饲料添加剂。本专利技术的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因在血液、中肾、头肾、 脾、鳃、肠、心中大量转录，在脑、肌、肝、皮中有微量转录，在鳍条中检测到极其微量mRNA的存在。该基因从尾鳍期开始大量转录，在鱼苗3天达到最大表达量。根据本专利技术的gcTIMP-2的基因序列和氨基酸序列，以及其它已知物种的TIMP-2 相应序列，采用生物信息学方法可得出TIMP-2在不同物种之间的进化关系和保守程度。本专利技术对研究TIMP-2的生理功能，TIMP-2与肿瘤侵袭转移，胚胎发育和伤口愈合的关系及其对于嗜水气单胞菌毒力的抑制提供了实验基础，τ并为该基因在草鱼的人工育苗中的作用和在饲料添加剂中的应用提供实验基础。附图说明图1为Signal P程序分析显示出的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子_2 (gcTIMP-2) 基因的信号肽位置示意图。图1表明通过Signal P程序对其蛋白存在信号肽的可能性进行了分析，发现其N-端的M个氨基酸肽段极有可能为信号肽，其信号肽酶的可能切割位点位于第M位和25位氨基酸之间，提示该蛋白为分泌型蛋白。图2为RT-PCR检测草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因在草鱼组织中的表达图谱示意图。图2表明该基因在血液、中肾、头肾、脾、鳃、肠、心中大量转录，在脑、 肌、肝、皮中有微量转录，在鳍条中检测到极其微量mRNA的存在。图3为RT-PCR检测草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因在草鱼胚胎发育过程中的表达图谱示意图。图3表明该基因从尾鳍期开始大量转录，在鱼苗3天达到最大表达量。具体实施例方式本专利技术以下具体实施方式仅限于对本专利技术的说明，并构成对本专利技术保护范围的限制。1、序列比对根据Ironl995年的报道，只要两个序列间用BLAST软件比对后Ε-Value值小于 0.005，两个序列之间具有绝对的同源性，即证明序列为同一种基因序列。依据本实验室已有的草鱼头肾cDNA文库所标记的EST序列，在NCBI进行BLAST检索。得到草鱼TIMP-2基因的部分编码区和3’端核苷酸序列。根据该序列设计基因特异性引物。2、草鱼 TIMP-25，端克隆草鱼总RNA提取采用TaKaRa公司的组织RNA提取试剂提取草鱼总RNA，经琼脂糖凝胶电泳证明所提取总RNA没有降解，没有DNA污染，可满足后续实验要求。按Clontech公司SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行，包括下列步骤(1)第一链 cDNA 合成1. 0 μ 1 草鱼总 RNA (1 μ g)1. 0μ 1 5，-CDS 引物 A(5，-(T)25VN-3，N = A, C，G，or T ;V = A, Gor C)1. 75μ 1 去离子水将上述试剂在0. 2ml离心管内混勻，72°C 2分钟，42°C 2分钟，然后再加入下列试剂1. μ 1 SMART 寡核苷酸(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX-3')2.0μ15X第一链缓冲液1. Ομ 1DTT (20 mM)Ι.Ομ 1dNTP Mix (IOmM)0.25 ulRNA 酶抑制齐IJ (40U/u 1)Ι.Ο本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种草鱼基质金属蛋白酶抑制因子－２基因，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李家乐，徐晓雁，沈玉帮，宣云峰，王荣泉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：31
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