当前位置: 首页 > 专利查询>陈滔专利>正文

一种快速筛选钙离子通道拮抗剂的方法技术

技术编号:6902954 阅读:311 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术属于医药技术领域,具体涉及一种高通量筛选钙离子通道拮抗剂的方法。一种高效筛选钙离子通道拮抗剂的方法,该方法包括以下步骤:1)制作稳定的带钙离子通道的细胞株;2)剂量效应标准曲线的制备;3)筛选。本发明专利技术是利用钙离子对细胞的毒性对钙离子通道的拮抗剂和调节剂进行快速高频筛选,一天可获得几百甚至上千个实验数据,成本大大降低,操作人员在简单训练后即可掌握。因此,与现有技术相比,本发明专利技术的方法不仅在速度上具有较大的优势,而且可使成本由原来的一个数据点$50左右降至$1左右,具有很大的价格优势和发展前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
,具体涉及一种高通量筛选钙离子通道拮抗剂的方法。
技术介绍
钙离子通道是常见的药物靶器官,钙离子通道拮抗剂广泛应用于心血管疾病,如高血压、心率失常和心衰等各种疾病。因其作用显著,受到各大医药公司的青睐,每年对大量化合物进行筛选以求证其对钙离子通道的作用,其中绝大部分是对其拮抗作用的筛选。传统的钙离子通道拮抗剂的筛选方法用的是结合法(Binding Assay),这种方法是化合物和已知钙离子通道的结合位点结合,根据其结合的强弱来判断化合物的拮抗性。 这种方法的缺点是结合位点已知,也就是说无法对未知的阻断结合点进行药物筛选,一般需要同位素作为检测手段,对人体和环境具有潜在的危害,更由于其筛选出的阳性化合物虽有和钙离子通道结合的能力但并不一定有拮抗的效果,因而逐渐淘汰。取以代之的以荧光为基础的Flippr Assay法,钙离子通道开放引起的钙离子向细胞内涌入,进而结合事先置入的荧光蛋白。这类荧光蛋白可根据细胞内钙离子的强弱而发出不同强弱的荧光,从而检测荧光的强弱可判断进入细胞的钙离子的多少。最近几年兴起的I^atchXpress,Qpatch 和IonWorks等仪器建立在传统的电生理的基础上,从而克服了结合法(Binding Assay)和荧光法(Flippr Assay)的缺点,使药物筛选过程更接近于生理状态,缺点是成本很高。无论以上哪种方法,操作人员都需要一定的专业知识,长期的训练;更重要的是筛选成本都比较高。药物筛选领域追求的是低成本高速度,即多少美元一个数据点和一天多少数据点。关于能采集多少数据点一天,以上各方法并不相同,但至少达到半高通量的要求,然而,成本却居高不下,便宜也要$50 —个点左右。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的成本高缺陷提供一种利用细胞毒性高频筛选钙离子通道拮抗剂的方法,该方法并不需要昂贵的实验仪器,操作人员只需要简单训练即可掌握,而且也达到或超过半通量的要求,具有高效、易学、易用和廉价等优点,可快速筛选钙离子通道拮抗剂。本专利技术的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的 一种高效筛选钙离子通道拮抗剂的方法,该方法包括以下步骤1)制作稳定的带钙离子通道的细胞株;2)剂量效应标准曲线的制备将等量的带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内,再加入经梯度稀释的钙离子通道阻断剂,以此同时加入ΙμΜ Bay K,培养至少M 小时后测量细胞的存活率,以细胞存活率对钙离子通道阻断剂Mtrendipine的浓度绘制曲线,得到剂量效应标准曲线;3)筛选将带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内,每个孔内带钙离子通道的细胞株的量与步骤幻中带钙离子通道的细胞株的量的加入量相同,再向孔内加入待筛选化合物,得到的数值与剂量效应标准曲线对照,确定其是否对钙离子通道有阻断作用。本专利技术是利用钙离子内流至细胞内,可引起细胞死亡这一原理而设计的。一般情况下,细胞膜内外两侧有一个在-70到-90毫伏之间的电压差(膜电压),如心肌细胞和神经细胞等。HEK293细胞相对特殊,它的膜电压在-20到-40毫伏之间。钙离子通道是一种电压敏感性通道,在处于-70之-90毫伏的静息电位时,离子通道是关闭的;细胞内外的钙离子并不交流;而电压上升到一定程度时,也就是说在某一特定的电压段,离子通道会被打开 (激活状态)。-40毫伏的膜电压正好达到了钙离子通道的开放域值;HEK293细胞的膜电位真好在-20到-40毫伏之间。那么,钙离子克隆在这类细胞株上,钙离子通道将处于持续激活状态,即连接细胞内外的,在细胞膜上的钙离子通道一直处在开放状态。从单个钙离子通道来说,钙离子通道开放后会迅速失活。失活的概念指的是在离子通道开放的条件继续存在的条件下,离子通道不再开放的一种状态。克隆了钙离子通道的HEK293细胞上有很多钙离子通道,作为特定的单个离子通道,它在开放后,迅速失活;但以整个细胞的钙离子通道来说,始终会有一些通道在一定条件下处于开放状态;而这个特定条件就是细胞膜之间的膜电压在-20到-40毫伏左右。有实验证明在-40毫伏到-20毫伏之间,始终有一定数量的钙离子通道处于开放状态。由于钙离子在细胞内外存在浓度差, 细胞外的钙离子浓度要远远高于细胞内的钙离子浓度,这样在钙离子通道开放的情况下, 钙离子顺着离子浓度梯度从细胞外进入细胞内。钙离子在细胞内浓度升高,可引起各种生理现象,也可引起细胞自然死亡。如果能阻止钙离子的内流,细胞就不会死亡。这样,一个化合物是否对钙离子通道有阻断作用,就可以在细胞的死亡率上表现出来。这种不同的死亡率,就可以用来对钙离子他的的阻断剂进行筛选。这个专利就是利用离子通道的这一特点进行药物筛选。在实验中用到的Bay K,可以增加钙离子通道的开放。虽然原理上有待进一步探讨,但一般认为它作用在钙离子通道的失活期,从而使离子通道开放时间大大延长。实验中使用Bay K可以使细胞死亡率增高以增加筛选的敏感度。这个专利技术的高效是和IonWorks以及PatchXpress,Qpatch相比较的,Molecular Devices公司的IonWorks Quattro是目前速度最快的仪器,其网站认为在6小时内可获 2300个资料点。这个数据并不反映实际情况,Quattro用的是384孔板,除去阳性和阴性对照后是320个空,即百分之百成功一次可得320个数据点。一个实验程序一般需要70 到120分钟,加上每次实验前的一些必须准备(如处理细胞等),一天8小时最多能完成4个实验,即1280个数据点,钙离子通道的实验程序一般需要2小时,数据点更少。Molecular Devices公司的PatchXpress和Sophion的Qpatch属于同一类型的产品,采用16空板,即最多可得到16个细胞,属于半高通量的筛选仪器。由于这类产品在一个细胞上能得到多个点(可得到5个点一个细胞),成功率可达50% ;—天8小时,可完成6次实验,即一天可获得240个点,但在实践中,很少有达到200个点的。本专利技术采用的是96空板,除去阳性和阴性对照后是80个空,即可获80个数据点一次。本方法可用多种测试方法,其速度也和测试方法相关。如果用目测法,按我的测试,每空平均需要25秒,不到半分钟,即一整个板不需要50分钟,一天测8个板或640个数据,不应有问题;也可以用Vi-Cell (Vi-Cell XR, Cell Viability analyzer, Beckman Coulter)来测量细胞的存活率,Vi-Cell 是专门用来测细胞存活率的仪器,一般好点的实验室都会有类似的仪器。Vi-Cell的测试速度并不快,和目测不相上下,一天可得640个数据或8个板;但它可节省很多人力。另外,各种扫描仪(microplate reader)也可以执行任务。比如,GE IN Cell Analyzer 1000 是用于 High content Analysis的仪器,也可在本专利技术中运用,它的扫描速度和曝光以及图像数量有关, 96孔板需要1到4小时,在本实验应用中只需1小时,8小时内,可得640个数据点。由于测试前细胞不需要进一步处理,如果再接上自动传递装置,理论上可进行M小时测试,从而达到近2000个数据点。在成本上,采用目测法本文档来自技高网
...

【技术保护点】
道的细胞株的量与步骤2)中带钙离子通道的细胞株的量的加入量相同,再向孔内加入待筛选化合物,得到的数值与剂量效应标准曲线对照,确定其是否对钙离子通道有阻断作用。同时加入1μM Bay K, 培养至少24小时后测量细胞的存活率,以细胞存活率对钙离子通道阻断剂Nitrendipine的浓度绘制曲线,得到剂量效应标准曲线;3)   筛选:将带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内,每个孔内带钙离子通1.一种高效筛选钙离子通道拮抗剂的方法,其特征在于该方法包括以下步骤:1)   制作稳定的带钙离子通道的细胞株;2)   剂量效应标准曲线的制备:将等量的带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内,再加入经梯度稀释的钙离子通道阻断剂,以此

【技术特征摘要】
2010.05.28 CN 201010185802.61.一种高效筛选钙离子通道拮抗剂的方法,其特征在于该方法包括以下步骤1)制作稳定的带钙离子通道的细胞株;2)剂量效应标准曲线的制备将等量的带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内,再加入经梯度稀释的钙离子通道阻断剂,以此同时加入ΙμΜ Bay K,培养至少M 小时后测量细胞的存活率,以细胞存活率对钙离子通道阻断剂Nitrendipine的浓度绘制曲线,得...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈渊陈滔
申请(专利权)人:陈滔
类型:发明
国别省市:33

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1