本发明专利技术公开了一种基于量子点的免疫荧光检测盐酸克伦特罗的方法及专用试剂盒。本发明专利技术提供的用于检测盐酸克伦特罗的免疫荧光检测试剂盒，包括盐酸克伦特罗包被原和量子点标记的盐酸克伦特罗抗体。本发明专利技术方法能实现对盐酸克伦特罗残留药物的定量检测，并且检测限低、检测灵敏度高、特异性好，还适用于多种样品的检测。因此，本发明专利技术在盐酸克伦特罗的检测领域具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于量子点的免疫荧光检测盐酸克伦特罗的方法及专用试剂盒。
技术介绍
盐酸克仑特罗(ClenbuteroLCL)属于β -兴奋剂，近年来被非法添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长，因其添加剂量是治疗剂量的5-10倍，以至于在动物体内残留量高而给消费者带来危害。目前，用于盐酸克伦特罗残留物定量检测的金标准是色谱/质谱法，但其样品前处理过程繁琐费时，检测费用高。基于竞争性酶联免疫反应原理的ELISA方法不需进行复杂的样品前处理过程，检测时间相对短，但其精度不够，只能用于定性筛查，无法用于定量确证。当前畜产品中检测盐酸克伦特罗残留及其污染状况调查的样品数量大，任务重，花费高，检测周期过长。因此，急需检测结果稳定、快速、经济的标准方法。量子点(Quantum Dots, QDs)标记材料是近年来发展起来的一类新型材料，包括 II-VI族和III-V族半导体纳米晶。由于量子点突出的发光和吸收特性，使其具有荧光寿命长、宽激发光谱、窄发射光谱、可精确调谐的发射波长、很高的光化学稳定性、可进行多色标记等优越特性，采用其作为标记材料，可实现对靶标分子的超微量检测。由于适用于免疫诊断试剂的量子点标记材料必须满足量子产率高、荧光强、生物相容性好、高度稳定及成本低等要求，而现行国外商业化的量子点其量子产率多在40%以下，其尺寸偏小，需要用激光光学仪器来照射激发，目前仅能应用在细胞免疫荧光检测和流式细胞检测和分选等方面，因此国际市场上还没有量子点免疫检测试剂问世。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于检测盐酸克伦特罗的免疫荧光检测试剂盒。本专利技术所提供的用于检测盐酸克伦特罗的免疫荧光检测试剂盒，包括盐酸克伦特罗包被原和量子点标记的盐酸克伦特罗抗体。上述试剂盒中，所述盐酸克伦特罗抗体为抗体效价为IO6以上(具体为IO6)、抗体亲和常数为IO6 IO8M4或IO7 IOi1或IOi1的盐酸克伦特罗单克隆抗体；具体为抗体效价为106、抗体亲和常数为IO8M-1的盐酸克伦特罗单克隆抗体，所述盐酸克伦特罗单克隆抗体购自北京圣迪隆生物科技有限公司，产品目录号为CL-083。所述量子点为表面羧基含量为IX 10_3 9X 10-3mmol/mg或1 X 10_3 6X 10_3mmol/mg或5X 10_3mmol/mg的水溶性CcKe/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40 70%或50 70%或60% ；所述量子点的激发光波长为345nm，发射波长是 620nmo上述任一所述试剂盒中，所述量子点的粒径为10 20nm，所述粒径具体为13 20nm，所述粒径尤其优选为20nm ；其粒径的偏差(CV)在10 30%之间，具体为10 20%3之间，再具体为15% ；上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的盐酸克伦特罗抗体中，所述量子点上的羧基与所述盐酸克伦特罗抗体上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述盐酸克伦特罗抗体连接。上述任一所述试剂盒中，所述盐酸克伦特罗包被原为盐酸克伦特罗与载体蛋白的偶联物，其中所述盐酸克伦特罗与所述载体蛋白通过盐酸克伦特罗中的羧基与载体蛋白中的氨基形成的肽键而连接；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、 甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白、纤维蛋白原和兔和鸡的丙种球蛋白中的任一种。上述任一所述试剂盒中，所述试剂盒中还包括盐酸克伦特罗标准品、稀释液、洗涤液、含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；所述盐酸克伦特罗标准品为4-氨基- α -(叔丁胺甲基)_3，5- 二氯苯甲醇盐酸^rt.；所述稀释液为PBS缓冲液；具体为0. 02Μ、ρΗ7. 4的PBS缓冲液。所述洗涤液为PBST缓冲液；具体按照如下方法制备取0. 2ml TWeen20及0. Ig的 NaN3溶于所述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；具体为0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液。所述封闭液为含有用于包被的蛋白的PBS缓冲液；所述用于包被的蛋白为BSAjP 清蛋白和血蓝蛋白中的任一种。具体按照如下方法制备将IOg BSA和0. 2mlTween20溶于上述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。上述任一所述试剂盒中，所述标准品为如下溶液形式的标准品用所述稀释液将所述4-氨基-α -(叔丁胺甲基)_3，5- 二氯苯甲醇盐酸盐稀释成如下各个浓度的溶液 0. 001、0. 005、0. 0U0. 05、0· 1、0· 5、1、5、10ug/L。上述任一所述试剂盒中，所述盐酸克伦特罗包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法为用所述包被缓冲液稀释所述盐酸克伦特罗包被原得到10yg/ml的包被液，每孔中加100 μ 1。上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的盐酸克伦特罗抗体以如下溶液形式存在于试剂盒中将每25ug所述量子点标记的盐酸克伦特罗抗体用5ml所述稀释液稀释得到的溶液。本专利技术的另一个目的是提供一种检测样品中盐酸克伦特罗的方法。本专利技术所提供的检测样品中盐酸克伦特罗的方法，包括如下步骤用上述任一所述的试剂盒对待测样品进行检测，所述待测样品为动物肌肉组织样本、动物尿样或饲料。所述待测样品具体为猪尿。本专利技术检测方法的原理采用量子点作为荧光信号标记分子，将盐酸克伦特罗抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，加入盐酸克伦特罗标准品或检测样品，以及量子点标记的盐酸克伦特罗抗体，使其形成抗原-抗体二元发光免疫复合物，用荧光检测仪激发并检测该免疫荧光复合物的荧光强度，通过与测定形成的标准曲线对比获得待测盐酸克伦特罗的浓度。抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是加入量子点标记的盐酸克伦特罗抗体后，包被的盐酸克伦特罗抗原与检测样品中的盐酸克伦特罗竞争性地结合盐酸克伦特罗抗体，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物。抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是同时加入量子点标记的盐酸克伦特罗抗体及检测样品后，包被在聚苯乙烯微孔中的盐酸克伦特罗抗原与检测样品中的盐酸克伦特罗竞争性地与盐酸克伦特罗抗体结合，其中与检测样品结合剩余的盐酸克伦特罗抗体与包被在微孔板中的盐酸克伦特罗抗原发生特异结合后形成固定在微孔板中的抗原-抗体二元免疫复合物。本专利技术的盐酸克伦特罗免疫荧光检测试剂与量子点标记的免疫荧光检测技术相关，是采用量子点作为荧光信号标记材料，进行免疫荧光定量测定的一类方法，该技术整合了荧光量子点纳米材料化学合成、表面修饰及标记技术、间接竞争式免疫检测技术等相关领域的研究。本专利技术之所以能检测盐酸克伦特罗，在于采用了一种基于量子点标记的免疫荧光定量测定的方法，即将盐酸克伦特罗抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，基于量子点标记的间接竞争免疫荧光检测法的测定原理，在加入盐酸克伦特罗标准品或检测样品，以及量子点标记的盐酸克伦特罗抗体后，通过检测结合到聚苯乙烯板微孔中的抗原-抗体二元免疫复合物的荧光强度来实现对盐酸克伦特罗的检测结合到聚苯乙烯板微孔的量子点标记抗体的数量不同，所产生的荧光强度也不同。在一定浓度范围内荧光强度值的高低与样品中的盐酸克伦特罗的含量成反比。通过添加不同浓度的盐酸克伦特罗标准品可制成标准曲线，根据此标准曲线查询各检测样品的荧光强度值可得到对应的盐酸克伦特罗药物本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测盐酸克伦特罗的免疫荧光检测试剂盒，包括盐酸克伦特罗包被原和量子点标记的盐酸克伦特罗抗体。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测盐酸克伦特罗的免疫荧光检测试剂盒，包括盐酸克伦特罗包被原和量子点标记的盐酸克伦特罗抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述盐酸克伦特罗抗体为抗体效价为IO6以上、抗体亲和常数为IO6 IO8M-1的盐酸克伦特罗单克隆抗体；所述量子点为表面羧基含量为1 X 10_3 9X 10_3mmol/mg的水溶性Cdk/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40 70%。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述量子点的粒径为10 20nm，其粒径的偏差在10 30%之间；所述盐酸克伦特罗包被原为盐酸克伦特罗与载体蛋白的偶联物。4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括盐酸克伦特罗标准品、稀释液、洗涤液、含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；所述盐酸克伦特罗标准品为4-氨基- α -(叔丁胺甲基)_3，5- 二氯苯甲醇盐酸盐；所述稀释液为PBS缓冲液；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；...
【专利技术属性】
技术研发人员：马岚，袁航，吴峰，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：94
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