本发明专利技术涉及一种检测肿瘤标志物的生物电化学传感器及其制备方法。为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有与两种肿瘤标志物的DNA适体互补的DNA链，即cDNA链，并在该cDNA链末端标记上电化学探针二茂铁分子。本发明专利技术的检测肿瘤标志物的新型生物电化学传感器结合了DNA适体高特异性结合靶蛋白以及电化学检测方法高灵敏度的特点，使癌症的早期诊断成为可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型生物电化学传感器及其制备方法，特别是一种。
技术介绍
癌症是严重威胁人类健康的具有高发病率和高死亡率的疾病之一，然而，若在癌症发展的早期阶段即能将其诊断出来，将大大提高病人的存活率。可以说，早期诊断和早期治疗是预防癌症发展和降低死亡率最有效的办法之一。肿瘤标志物是在肿瘤发生和增殖过程中由肿瘤细胞所产生、分泌并释放到血液、细胞、体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。它是肿瘤细胞在人体内存在状态的具体表征，可以直接反应肿瘤细胞在体内的发展以及患者治疗效果等情况。目前已有少量肿瘤标志物被应用于临床检测。然而，单个肿瘤标志物的检测往往导致肿瘤检测的假阳性或假阴性，如果能同时检测多种肿瘤标志物则可以大大提高肿瘤检测的灵敏性、特异性和准确性。近来，研究人员报道了一种称作适体的分子探针。适体为单链DNA、RNA或是经过修饰的核酸，是通过一种体外选择过程SELEX(指数富集的配体系统进化)产生的。在SELEX 技术中，能从大量的单链随机寡核苷酸文库中筛选出能与靶物质高特异性、高亲和力结合的核酸配基，即为适体。在已经报道的文献中，适体可以结合小分子物质诸如三磷酸腺苷 (ATP)，或是大分子物质如蛋白质，甚至可以与细胞特异性结合。由于具有高特异性识别靶物质、低分子量、合成简便、易于修饰、低毒性、高稳定性等特点，适体越来越多被应用于各项研究以及生物传感器的设计。目前，已有多种肿瘤标志物的适体被筛选出来，为适体应用于肿瘤标志物的检测奠定了基础。电化学生物传感器是一类以电极作为信号转换器，以电位或电流加以测量的生物传感器。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极(也称对电极)和参比电极， 其中的对电极是钼电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，电流流经工作电极和对电极。工作电极所测得的电位是相对于参比电极而言。电化学方法作为一种分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。其中，方波伏安法具有很高的灵敏度，因此常应用于高灵敏度的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种联合检测两种肿瘤标志物的新型生物电化学传感器。本专利技术的目的之二在于提供该传感器的制备方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种检测肿瘤标志物的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是钼电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有与两种肿瘤标志物的DNA适体互补的DNA链，即cDNA链，并在该cDNA链末端标记上电化学探针二茂铁分子在上述的金电极上修饰有两种肿瘤标志物的DNA适体互补的DNA链。在上述的金电极上修饰有与两种肿瘤标志物的DNA适体互补的DNA链，该DNA链为带有巯基的cDNA链，其碱基序列分为两部分，第一部分与第一种肿瘤标志物的适体链互补，第二部分与第二种肿瘤标志物的适体链互补。上述的第一种肿瘤标志物为粘蛋白1 (MUC1)，第二种肿瘤标志物血管内皮生长因子(VEGF165)；所述的带有巯基的cDNA链的碱基序列具体为5’-SH-(CH2) 6_AGGAT CAACT GCGGC CAGCA CACCC AGATC CT-NH2-3'。一种制备上述的检测肿瘤标志物的生物电化学传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为a)将处理过的金电极置于0.5M H2SO4中，在0 - 1.6 V的电压范围内进行循环伏安扫描，扫速为100 mV/s，直至达到稳定；b)将该金电极置于含有巯基cDNA链溶液的Eppendorf管中，该溶液含有浓度为1μ M 的巯基 cDNA 链、10 mM Tris_HCl，pH 为 7. 8、1 mM EDTA、0. 1 M NaCl 禾口 10 mM 的三氯乙基磷酸酯，倒置16小时，再浸入2 mM巯基己醇水溶液中1小时，用超纯水冲洗，即得到cDNA 链修饰的金电极；c)将cDNA链修饰的金电极浸入5mM 1_ (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)、25 mM N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、5 mM 二茂铁羧酸的混合溶液中，37° C水浴2小时，得到所需的工作电极；d)将该工作电极与对电极和参比电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器。上述的巯基cDNA 链的碱基序列具体为5’-SH-(CH2)6-AGGAt CAACT GCGGC CAGCA CACCC AGATC CT-NH2-3'。。本专利技术第一次在金电极表面修饰上与两种肿瘤标志物MUCl和VEGF165的DNA适体互补的cDNA链，并在此cDNA末端带有电化学探针二茂铁，在检测过程中，用二茂铁作为电信号的探针分子。当样品中无肿瘤标志物存在时，待测液中两种肿瘤标志物的DNA适体链同时以自由状态存在时，金电极上修饰的cDNA链将会与两种适体链分别杂交，形成刚性结构的DNA双链，拉远Fc与金电极表面的距离，使检测到的电信号减弱；而当样品中有肿瘤标志物存在时，肿瘤标志物即会与相应的DNA适体链分别结合，从而使待测液中呈自由状态的DNA适体链减少，金电极表面修饰的cDNA就不能与适体链杂交而依然保持单链，在一定条件下形成茎环结构，使cDNA链末端的Fc与金电极表面的距离靠近，使检测到的电信号增强。由此，通过金电极上修饰的cDNA链构象的变化导致探针分子电信号的改变，实现对两种肿瘤标志物的联合检测。本专利技术构建了一种联合检测两种肿瘤标志物的新型电化学传感器，取得了满意的结果。同样的原理还可推广到其它两种或多种肿瘤标志物的联合检测，应用前景广泛。附图说明图1 为在 0. 1 M 磷酸缓冲液(PBS)和 5 mM 铁氰化钾(K3 /K4 ) 溶液中，a 裸金电极；b 修饰了 cDNA链的金电极的阻抗图。图2为在0. 1 M高氯酸钾溶液中，a 修饰有cDNA链的金电极；b :cDNA链标记上Fc后的方波伏安曲线。图3为在0. 1 M高氯酸钾溶液中，a 修饰有cDNA链的金电极；b_f 依次为加入不同浓度的肿瘤标志物MUCl (InM, 5nM，IOnM, 20nM, 40nM) ；g :Fc_cDNA的方波伏安曲线。图4为在0. 1 M高氯酸钾溶液中，固定一种肿瘤标志物MUCl浓度为40 nM, a-e 依次为加入不同浓度的肿瘤标志物VEGF165 (InM, 5nM，IOnM, 20nM, 40nM);f :Fc_cDNA的方波伏安曲线。图5为在0. 1 M高氯酸钾溶液中，a 修饰有cDNA的金电极；b 加入100 nM的血清白蛋白(BSA) ；c :Fc-cDNA的方波伏安曲线。具体实施例方式实施例一 cDNA链修饰的金电极的制备将待处理的金电极在含有氧化铝(粒度分别为1 μπι，0.3 μπι,Ο. 05 μ m)砂浆的丝绸上依次抛光，再用乙醇、超纯水分别超声清洗5分钟，随后在金电极的表面滴10 μ L水虎鱼溶液( :&H2S04=3:1)作用2分钟，用超纯水冲去后，将金电极置于0.5 M硫酸溶液中， 在0 - 1.6 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为100 mV/s，约20圈达到稳定，用氮气吹干，即得到表面处理干净的裸金电极，可以用于巯基cDNA的修本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测肿瘤标志物的生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有与两种肿瘤标志物的ＤＮＡ适体互补的ＤＮＡ 链，即ｃＤＮＡ链，并在该ｃＤＮＡ链末端标记上电化学探针二茂铁分子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李根喜，赵婧，郭超，赵洪喜，吴瑶，陈阳阳，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：31
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