本发明专利技术涉及盐芥COR15a基因启动子及其应用，该启动子具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明专利技术特别涉及该启动子序列中的2个低温应答特异性元件C-repeat/DRE。本发明专利技术从克隆盐芥COR15a基因启动子入手，通过对盐芥COR15a基因启动子结构和功能序列的分析，验证了盐芥COR15a基因启动子的低温诱导性。从盐芥中获得的该低温诱导型启动子，为植物抗逆基因工程研究提供了新的逆境胁迫诱导型启动子元件，也为下一步植物抗冻转基因研究奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体地说，涉及一种盐芥CORlfe基因启动子及其应用。
技术介绍
盐芥(Thellungiella halophila)具有很强的抗冻能力。据报道，在4 5°C低温条件下，盐芥种子可以萌发，并且盐芥可以生长发育。盐芥的抗冻能力比拟南芥要强，表现在拟南芥在经过过冷处理之后才能够忍受零度以下低温，如忍受-10 -13°C的低温，而盐芥不仅在经过过冷处理后能够忍受低温，其本身就具有更强的抗冻能力。越来越多的研究表明，植物抗冻过程中发生的生理生化变化是由低温诱导的特定基因表达而引发的，一些潜在的基因受低温调控而表达，进而诱导许多抗冻蛋白的合成。 Iliomashow等(1990)最早从拟南芥中分离鉴定得到抗冻响应的COR基因(cold regulated gene)。C-r印eat/DRE (c-r印eat/drought responsive element)调节元件是 COR 基因启动子序列中的关键顺式作用元件(Yamaguchi-Siinozaki等，1994 ；Baker等，1994)。所有 COR基因启动子序列中都有此调节元件存在。研究证明，C-repeat/DRE调节元件除了可响应低温诱导外，还可对干旱和高盐等作出响应而使COR基因表达。CORlfe基因启动子是植物体内低温调节的信号转导途径及转录调控网络中的重要组成部分。本专利技术首次克隆得到盐芥CORlfe基因启动子的序列，为进一步研究植物的抗冻分子机制奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供盐芥CORlfe基因启动子及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的盐芥CORlfe基因启动子，其具有i)SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列，该序列中含有2个低温应答特异性元件C-r印eat/DRE ；或ii)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。如在不改变启动子功能的情况下，将第12位的A缺失，将第177位的A取代为G，在第211位后增加T。本专利技术还提供含有上述启动子的载体以及含有该载体的宿主细胞。本专利技术还提供含有上述启动子的转化植物细胞。本专利技术还提供盐芥CORlfe基因启动子在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GFP基因。 本专利技术还提供盐芥CORlfe基因启动子在提高植物抗逆性中的应用。其中，所述的植物抗逆性是指植物的抗冻、抗旱和抗盐等抗逆境胁迫的能力，特别是指植物的抗冻能力。 本专利技术从克隆盐芥CORlfe基因启动子入手，通过对盐芥CORlfe基因启动子结构和功能序列的分析，验证了盐芥CORlfe基因启动子的低温诱导性。从盐芥中获得的该低温诱导型启动子，为植物抗逆基因工程研究提供了新的逆境胁迫诱导型启动子元件，也为下一步植物抗冻转基因研究奠定基础。附图说明图1为盐芥和拟南芥CORlfe启动子中调节元件的分布图。其中，中间部分表示盐芥和拟南芥CORlfe启动子共有的调节元件；左环表示盐芥CORlfe启动子含有的元件；右环表示拟南芥CORlfe启动子含有的元件。图2为盐芥和拟南芥的CORlfe启动子下游序列的比对。图3为盐芥CORlfe基因启动子表达载体、缺失载体及对照载体的构建。其中， +1示转录起始位点(TSQ ；ATG示翻译起始密码子；A示ABRE ；B示TC_rich repeats ；C示 GARE-motif ；Control为以拟南芥CORlfe基因启动子构建的表达载体作为对照；以GFP为报告基因的载体为PCAMBIA1300。图4为不同温度处理下洋葱表皮细胞中不同启动子启动的GFP基因瞬时表达情况、其中，A、D、G是转化了 35S启动子的洋葱表皮细胞分别在30°C、20°C和4°C条件下处理后，35S启动子启动的GFP瞬时表达情况；B、E、H是转化了拟南芥CORlfe基因启动子At的洋葱表皮细胞分别在30°C、20°C和4°C条件下处理后，At启动子启动的GFP瞬时表达情况； C、F、I是转化了盐芥CORlfe基因启动子Th的洋葱表皮细胞分别在30°C、20°C和4°C条件下处理后，Th启动子启动的GFP瞬时表达情况。其中35S启动子样品和拟南芥CORlfe启动子At样品均为对照。Bar 10 μ m。图5为4°C条件处理下洋葱表皮细胞中缺失启动子启动的GFP基因瞬时表达情况。 图中从左至右依次为转化了 35S启动子、盐芥CORlfe基因启动子Th、盐芥CORlfe基因缺失启动子Th2的洋葱表皮细胞在4°C条件下处理后，3种启动子启动的GFP基因瞬时表达情况。其中，35S启动子样品为对照。BardOym。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。实施例1盐芥CORlfe基因启动子的克隆1材料和方法1. 1 材料1.1.1 植物材料 Shandong 生态型盐芥(Thellungiella halophila)；哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis Columbia)。1. 1. 2菌株和载体大肠杆菌菌株E. coli DH5 α、农杆菌GV3101均为市售商品； 载体pMD 18-T Vector,pMD 18-T simple Vector购自 TaKaRa公司；表达载体pCAMBIA1300 购自CAMBIA公司。1.1. 3 酶和化学试剂限制性内切酶 BamHI、HindIII、SmaI、PstI、T4 DNA Ligase 购自TaKaRa公司；DNA Marker购自广州东盛生物公司；抗生素购自Sigma公司。1. 2 方法1. 2. 1盐芥CORlfe基因启动子的克隆用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取盐芥基因组并进行DNA浓度及纯度的检测。登录NCBI生物信息数据库，检索获得盐芥(Thellimgiella salsuginea) CORlfe基因的cds全长序列(518bp)。以此cds片段为依据，设计三个特异性引物 SP1 (5 ‘ -TCTGCAAACTCAGCCGCTTTGTTTC-3 ‘ )、SP2 (5 ‘ -CCATCTTTCAACGCCTCCTTTGTC T-3')和 SP3(5' -AGCGACAACGACGAGCTCAGTTTTC-3‘)。用 TaKaRa Genome Walking Kit 进行第一次巢式PCR反应。以第一次染色体步移后测序得到的扩增序列为已知序列，设计三个特异性引物 SPl' (5' -GTCGGCCATCAAAGTTGTGGTTTAC-3‘ ) ,SP2' (5' -GCCAACAAGT TGGGCTATTATCGCC-3 ‘)和 SP3 ‘ (5 ‘ -GGCAACTCCTCCACCTTCTCTATGA-3 ‘)，仍采用 iTaKafci Genome Walking Kit继续扩增盐芥CORlfe基因启动子序列。1. 2. 2盐芥CORlfe基因启动子的生物信息学分析及同源比对用 PLANTCARE(http//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．盐芥ＣＯＲ１５ａ基因启动子，其特征在于，其具有：ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的核苷酸序列；或ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示核苷酸序列经取代、缺失和／或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由ｉ）衍生的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张根发，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。