本发明专利技术公开了一种壳聚糖修饰的智能型组织工程支架材料及其制备方法，本发明专利技术属于功能高分子材料领域，特别涉及智能型组织工程支架材料及其制备方法。壳聚糖修饰智能型组织工程支架材料温度响应范围为31℃-33℃，所述壳聚糖修饰智能型组织工程支架材料可由下述方法制得：通过紫外光固定化法，将温敏性物质N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酸(AAc)按一定比例溶于二甲基亚砜(DMSO)，以蒽醌-2-磺酸钠(AQS)做光敏剂，接枝到聚苯乙烯细胞培养板表面，然后以N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC·HCl)作活化剂和缩合剂，将生物相容性良好的壳聚糖(Cs)固定到聚苯乙烯细胞培养板表面，制备一种壳聚糖修饰的智能型组织工程支架材料。本发明专利技术所述制备方法工艺简单，可操作性强，投资成本低，适用范围广、安全，易在工业生产中普及应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种智能型组织工程支架材料及技术，特别涉及一种细胞培养和脱附用的温度敏感型支架材料及其制备方法。
技术介绍
组织和器官的损伤、缺失或衰竭是人类保健中发生最频繁、最具危害性和花费最高的问题之一，每年都有许多患者饱受组织和器官损伤或功能丧失的痛苦，这个问题也一直是困扰医学界的一大难题。目前对组织和器官损伤问题的治疗，多采用器官移植或人工代用品，但由于器官来源短缺、异体组织排斥、人工代用品不能完全代替人体器官功能和不能根据人体要求进行自动调节等因素，使此方面的研究受到很大限制，组织工程学的产生为解决这些难题开辟了崭新的道路。组织工程学是近20年来医学生命科学领域最具挑战性的前沿科技领域之一， 它标志着复制再生组织与器官时代的来临，与传统的治疗观念相比，组织工程克服了“以创伤修复创伤”、供体来源不足等缺陷，将从根本上解决组织、器官缺损的修复和功能重建等问题。传统组织工程学方法主要集中在两点(1)分离的细胞悬液注射入体内，进行病灶修复；( 将细胞种植在可生物降解的支架材料上，培养成组织，植入体内，进行组织修复与器官重建Shimizu T，Yamato M，Kikuchi A，et al. Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction. Biomaterials，2003，24 :2309-2316.。组织工禾呈学方法取得很多成果，也有大量产品上市，但存在的一些问题大大限制了它的发展。如细胞注射法只能有一小部分细胞与主体组织结合，不能形成大片的组织；传统组织工程学方法对支架材料要求苛刻，即必须具有良好的生物相容性，必须可生物降解，在体内降解后残留物不能有毒，且容易代谢掉等，另外，移植入体内的支架材料降解后，其留下的空间为增殖的细胞和细胞基质沉积物所占据，然而细胞基质沉积物容易引起组织的纤维化Yamato Μ, Akiyama Y, Kobayashi J et al. Temperature-responsive cell culture surfaces for regenerative medicine with cell sheet engineering. Prog Polym Sci,2007,32 1123-1133.。为解决这些问题，日本的Okano提出了 “细胞片层工程”的思想。细胞片层方法进行组织修复与器官重建，不是基于单个细胞，而是基于细胞片层，也就是将细胞在温度响应性支架材料表面进行培养，形成完整的细胞片层后，利用支架材料的温度响应性，使细胞片层从支架材料表面完整脱附，然后通过细胞片层的重叠，可形成三维结构，进行组织修复禾口器官重建Yamato Μ, Okano Τ. Cell sheet engineering. Materialstoday, 2004, 7 (5) 42-47.。细胞片层方法仅仅将细胞片层植入受损部位，并不将支架材料植入体内，这样由支架材料引起的各种问题将迎刃而解，可以说，“细胞片层工程”思想的提出，预示了新的组织工程时代的来临。目前应用最为广泛的温敏材料是聚异丙基丙烯酰胺(POTPAAm)。聚异丙基丙烯酰胺分子内存在亲水基团(酰胺基)和疏水基团(异丙基)，其水溶液的较低临界溶解温度(LCST)为32°C，当温度低于其LCST时，PNIPAAm分子链呈伸展状态，亲水基团暴露，表现亲水性，与水发生水合作用而溶于水，其水溶液呈透明状；当温度高于其LCST时，PNIPAAm分子链收缩，疏水基团暴露，表现疏水性，从水溶液中沉析，其水溶液不透明。将PNIPAAm接枝到细胞培养板表面，可得到温敏性细胞培养板，在37°C细胞培养温度，各种细胞在温敏性细胞培养板表面吸附、增殖，形成细胞片层后，将细胞培养板移至低温环境(低于LCST)，利用 PNIPAAm的亲疏水性变化，细胞从材料表面自动脱附，避免了酶解法对细胞功能造成的损伤，可以得到完整的细胞片层。将PNIPAAm应用于细胞培养研究，实现了细胞脱附智能化，但PNIPAAm生物相容性差、细胞脱附速率慢限制了其发展，针对此方面的不足，本专利技术将生物相容性良好的壳聚糖 (Cs)引入PNIPAAm材料，一方面增强了材料的细胞性容性，另一方面，由于亲水性Cs的引入，大大增强了细胞的脱附速率。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，是2-氨基-2-脱氧-13-D-葡萄糖单体以 13(1-4)苷键连接的均聚物，是生物界唯一的聚阳离子多糖，具有碱性多糖特性，在结构上与人体内存在的糖胺聚糖类似，具有优良的生物相容性和生物可降解性，在体内可被降解为氨基葡萄糖，被人体吸收，是理想的细胞外基质材料，被广泛应用于生物医学、组织工程等领域。如壳聚糖和明胶溶液共混形成聚电解质配合网络，以网络中的水为致孔剂经冷冻干燥可制备多孔海绵。该类支架适于软骨细胞、角质形成细胞和成纤维细胞等的培养Shen F,Cui Y L,Yao K D.A study on the fabrication of porous chitosan/gelatin network scaffolds for tissue engineering. Polym Inter, 2000，49 :1596-1599.。张立国等张立国，潘继伦，李结良等.壳聚糖微载体的制备及原代大鼠肝细胞培养.中国修复重建外科杂志，2003，17 O) :157-160.通过反相悬浮交联制备微米级的壳聚糖微载体进行原代大鼠肝细胞培养，结果表明，肝细胞在壳聚糖微载体上保持良好的球形状态，白蛋白分泌可维持7d以上，最高分泌量达到沈.7μ g/Mh/mL。随着生物医学领域和组织工程的发展， 壳聚糖类仿生材料的研究越来越引起人们的关注，将壳聚糖支架与基因治疗相结合正成为研究热点，壳聚糖及其衍生物在组织工程中的应用前景相当广阔孔祥烨，郑静，王晓军， 等.壳聚糖在组织工程中的应用.中国医学工程，2009，17(3) :185 187.。经以上分析可知，材料经PNIPAAm修饰后，可通过其温度响应性，实现细胞的无损伤脱附，但由于其生物相容性差，不利于细胞在材料表面的吸附与增殖；材料经Cs修饰后， 增强了材料的生物相容性，有利于细胞在其表面的铺展与增殖，但由于不具温敏性，细胞不能自动脱附，采用传统酶解法脱附细胞，必将损伤细胞功能。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术结合壳聚糖(Cs)和PNIPAAm两种材料的优点，采用紫外光固定化法，将二者接枝到组织培养用聚苯乙烯板(TCPQ表面，制备一种生物相容性良好的温敏表面，应用于细胞培养与吸脱附行为研究，此支架不但促进行细胞的吸附与增殖，而且大大提高细胞的温度诱导脱附速率。本专利技术的目的在于提供一种能促进细胞的吸附与增殖，并且细胞可以快速自动脱附的温敏支架材料，并提供此材料的制备方法，该制备方法包括以下步骤(1)表面清洗将聚苯乙烯细胞培养板(TCPS)样品，清洗干净，干燥备用；(2) TCPS表面的温敏羧基化修饰将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和丙烯酸(AAc) 溶于二甲基亚砜(DMSO)，加入蒽醌-2-磺酸钠(AQQ做光敏剂，滴入几滴异丙醇。将处理好的TCPS样品放入上述反应液中，通N2密封，以高压汞本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种壳聚糖修饰的智能型组织工程支架材料，其特征在于所述壳聚糖修饰的智能型组织工程支架材料温度响应范围为３１℃－３３℃，所述壳聚糖修饰的智能型组织工程支架材料可由下述方法制得：（１）表面清洗：将聚苯乙烯细胞培养板（ＴＣＰＳ）样品，清洗干净，干燥备用；（２）ＴＣＰＳ表面的温敏羧基化修饰：将Ｎ－异丙基丙烯酰胺（ＮＩＰＡＡｍ）和丙烯酸（ＡＡｃ）溶于二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），加入蒽醌－２－磺酸钠（ＡＱＳ）做光敏剂，滴入几滴异丙醇，将处理好的ＴＣＰＳ样品放入上述反应液中，通Ｎ２密封，以高压汞灯照射，高压汞灯距离样品３０～４０ｃｍ，反应液深度为１～２ｃｍ．光照接枝完毕后，依次以无水乙醇、蒸馏水冲洗接枝样品，以除去未反应的小分子和没有修饰上的聚合物，然后真空干燥，得ＴＣＰＳ温敏羧基化表面ＴＣＰＳ－ＮＩＰＡ－ＡＡｃ；（３）ＴＣＰＳ表面的糖化修饰：将壳聚糖（Ｃｓ）和Ｎ－羟基硫代琥珀酰亚胺（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）溶于ＨＣｌ溶液，将ＴＣＰＳ－ＮＩＰＡ－ＡＡｃ样品放入其中，置于摇床上室温下震荡１～３ｄ，每天向反应体系加入一定量１－（３－二甲氨基丙基）－３－乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ·ＨＣｌ），反应完毕，以大量蒸馏水浸泡洗涤，真空干燥，得到壳聚糖修饰的智能型组织工程支架材料。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺晓凌，陈莉，王雅晨，
申请(专利权)人：天津工业大学，
类型：发明
国别省市：12
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