水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用。该终止子为一种DNA分子，为如下1)或2)或3)的分子：1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；2)与1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交的分子。利用本发明专利技术的终止子与不同的启动子配合，可提高外源基因在目的植物中的表达和累积水平，为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种水稻种子谷蛋白GluA-I基因终止子及其应用。
技术介绍
植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺性状的改良(如提高作物产量，增强抗病、抗虫、抗除草剂特性，改良品质等)，而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器。绝大多数禾本科作物具有产量高、生产成本低、耐储藏、生产规模容易控制、可直接食用等特点，并且其具备体内翻译后修饰的能力，因而成为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白(Ferritin)、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平累积。然而，进一步实现外源基因的高效表达必须在转录和转录后水平同时提高基因表达。启动子主要在转录水平调控基因表达，终止子则在转录和转录后水平同时起调控作用。尽管目前广泛应用的终止子，如NOS、0cS，与异源启动子组合后可启动报告基因在植物中的高表达，能够满足生物化学、生理学以及细胞定位方面的研究需求。然而，对于其他能够提高基因表达的终止子研究较少。由于一些重要农艺性状以及植物次生代谢产物都是由多基因控制，提高单个基因的表达对于相关性状改良作用不明显。通过传统转化方法， 如重复转化或杂交来实现多基因转化却费时费力。近年来发展起来的多基因转化系统可以在一个表达载体中同时插入多个基因，为了避免转基因同源性过高引起的转基因沉默，这些基因需要由不同的启动子驱动表达，不同的终止子终止转录。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一个终止子，名称为tGluA-Ι，该终止子与nos终止子相比，可以提高外源基因的表达水平。本专利技术所提供的终止子，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；2)与1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交的分子。所述严格条件可为如下50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0. SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS、0. 5M Na3POdPlmM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，1 X SSC，0. SDS中漂洗；还可为50°C，在 7% SDS,0. 5M Nei3PO4 禾口 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0. 5 X SSC，0. 1%SDS 中漂洗； 还可为50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0. IX SSC,0. 1% SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交， 在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。其中，序列表中序列1由498个核苷酸组成。含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本专利技术的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述DNA分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或 pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。使用所述DNA分子构建重组植物表达载体时，在外源基因转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子⑴biquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本专利技术的DNA分子构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个外源基因序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因， 赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对 methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。所述重组载体具体可为pGluB-3-tGluA-l。所述pGluB-3-tGluA-l是将 pGluB-3-nos中的nos终止子替换为序列表中序列1所示的tGluA_l终止子得到的重组载体。所述表达盒是指由启动子、由所述启动子启动转录的目的基因和位于所述目的基因下游的所述DNA分子组成的。其中，所述启动子可为组成型启动子或组织特异表达启动子(如胚乳特异性启动子)。所述目的基因可为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA 基因。本专利技术的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本专利技术所提供的培育转基因植物的方法，是将含有所述DNA分子的表达盒导入目的植物中，得到所述目的基因表达水平高于将如下表达盒导入所述目的植物的转基因植物将所述的表达盒中的所述DNA分子替换为胭脂碱合成酶的nos终止子得到的表达盒。所述目的植物具体可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，小麦，玉米，高粱或大麦，所述双子叶植物具体可为大豆，油菜，棉花，烟草，马铃薯，甘薯或油桐。所述转基因植物理解为不仅包含将所述含有所述DNA分子的表达盒转化目的植4物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该含有所述DNA分子的表达盒，也可用常规育种技术将该含有所述DNA分子的表达盒转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述DNA分子在培育转基因植物中的应用或作为终止子的应用也在本专利技术的保护范围内。利用本专利技术的终止子与不同的启动子配合，可提高外源基因在目的植物中的表达和累积水平，可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本专利技术的终止子及其应用为利本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．ＤＮＡ分子，其特征在于：所述ＤＮＡ分子为如下１）或２）或３）的分子：１）由序列表中序列１所示的核苷酸序列组成的ＤＮＡ分子；２）与１）限定的ＤＮＡ的序列至少具有７０％、至少具有７５％、至少具有８０％、至少具有８５％、至少具有９０％、至少具有９５％、至少具有９６％、至少具有９７％、至少具有９８％或至少具有９９％同源性的分子；３）在严格条件下与１）或２）限定的ＤＮＡ序列杂交的分子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曲乐庆，李文静，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11