牛皮质骨植骨材料的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种牛皮质骨植骨材料的制备方法，包括以下步骤：将洁净后的牛皮质骨块先进行脱脂、脱钙，再将其放入骨形态发生蛋白降解酶的抑制剂中浸泡，然后再经脱蛋白处理，最后经冷冻干燥后制得牛皮质骨植骨材料。本发明专利技术的制备方法步骤简单、用料来源广泛、成本低，制备得到的植骨材料具有抗原性低、成骨诱导能力强、生物力学强度高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于骨组织工程学领域，尤其涉及一种植骨材料的制备方法。
技术介绍
由于创伤、骨病等造成骨缺损的修复一直是骨科治疗的一个难题。自体骨和同种异体骨 移植应用广泛，疗效较好，但均有一定局限性。自体骨存在着来源受限，影响供区功能，增 加手术创伤及感染等缺点；同种异体骨来源也受到限制，且有传染艾滋病病毒、肝炎病毒等 疾病的危险。人工骨的孔隙结构、降解能力及生物性能远不及天然骨。异种骨作为一种生物 组织，具有来源广泛、价格低廉、易于大量获取等优点，具备天然的多孔网状结构和较好的 生物力学强度，比人工合成骨材料更易于吸收、替代和降解，目前越来越受到骨组织工程学 的重视。异种骨包括牛骨、猪骨、鹿骨，羊骨等，其中以牛骨和猪骨研究较多，又以牛骨的 应用研究最多，因其尺寸和力学强度更符合骨移植材料的要求。但牛骨作为一种异种骨具有 较强的抗原性，植入人体后能够诱发免疫排斥反应，因此必须通过各种处理方式来减弱其抗 原性。目前用于实验和临床的牛骨植骨材料是通过高温煅烧、冷冻和冻干、物理化学等处理， 植骨后效果多不理想。煅烧骨是将牛骨经高温煅烧除去骨中有机质而成，虽能彻底消除抗原 性，但对材料的力学性能和降解性能有影响，且破坏了骨中的天然活性诱导成分。通过理化 方法处理的牛骨由于强氧化剂的应用，去除抗原的同时破坏了成骨诱导因子和胶原结构，降 低了其成骨诱导性和力学强度。因此，经处理后力学性能较差，含成骨因子较低。因此，如 何对异种骨进行加工处理，使其在降低抗原性的同时也能很大程度地保留成骨诱导活性和适 当的生物力学强度，这对本领域技术人员开发出新型的植骨材料具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种抗原性低、成骨诱导能力强、 生物力学强度高的。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种，包 括以下步骤将洁净后的牛皮质骨块先进行脱脂、脱钙，再将其放入骨形态发生蛋白降解酶 的抑制剂中浸泡，然后再经脱蛋白处理，最后经冷冻干燥后制得牛皮质骨植骨材料。上述制备方法具体包括以下步骤 (1)洁净处理将牛皮质骨周围的软组织、骨膜及骨髓去净并切割成牛皮质骨块(大小可为长3mmx宽3mmx高5 mm)，用温水冲洗牛皮质骨块、沥干；所述牛皮质骨优选牛的长 管状骨中的皮质骨；(2) 脱脂在可密闭容器中盛入氯仿-甲醇混合溶液，将洁净后的牛皮质骨块放入该密 闭容器内浸泡，不断更换新的氯仿-甲醇混合溶液直至其不再变浑浊， 一般脱脂浸泡的时间为 48~72小时；所述氯仿-甲醇混合溶液中氯仿与甲醇的体积比为(1~3) : 1，优选控制在1 : 1， 而浸泡时的牛皮质骨块与氯仿-甲醇混合溶液的体积比优选控制在1 : 3;浸泡脱脂完毕后可用 蒸馏水将残留在牛皮质骨块上的有机溶剂冲洗干净；(3) 脱钙将脱脂后的牛皮质骨块放入盛有盐酸(浓度为0.6mol/L)的可密闭容器中浸 泡脱钙， 一般浸泡18~36小时即可，浸泡过程中可对盐酸进行更换，浸泡时的温度优选控制 在4t;浸泡脱钙完毕后可用蒸馏水漂洗至pH值接近中性，以使其接近人体生理的pH值水 平，漂洗后沥干；(4) BMP的稳定化将脱钙后的牛皮质骨块放入盛有6~12mmol/L的N-乙基马来酰亚 胺溶液的容器中(浓度优选10mmol/L)，室温下一般浸泡24~48小时即可，再沥干；N-乙基 马来酰亚胺溶液可以对抗骨组织中骨形态发生蛋白(BMP)降解酶，从而减少BMP的溶解， 提高植骨材料的成骨活性；(5) 脱蛋白处理将BMP稳定化后的牛皮质骨块放入盛有木瓜蛋白酶(;w/7d)溶液 的密闭容器中进行脱蛋白，每克牛皮质骨块需要300 900u(优选500u)木瓜蛋白酶进行处理， 所述木瓜蛋白酶溶液的pH值控制在5.0~7.5，牛皮质骨块与木瓜蛋白酶溶液的体积比控制在 1 : (1~6);在木瓜蛋白酶溶液中浸泡的温度控制在39 68'C (优选控制在50'C 6(TC)，浸泡 时间一般不短于18小时(优选18 36小时)；脱蛋白后可用蒸馏水冲洗、沥干；(6) 冷冻干燥脱蛋白处理后的牛皮质骨块在-72'C -80'C的温度下冻结干燥得到植骨 材料，并灭菌密封保存。与现有技术相比，本专利技术的优点在于首先，本专利技术选择了抗原性低、含成骨诱导因子 BMP较高且生物力学强度好的牛皮质骨作为原料，在选材上进行了第一次优化；其次，在植骨材料的制备过程中加入了BMP降解酶抑制剂以减少BMP的自溶，稳定BMP的活性，通 过不断释放自身BMP持续作用于宿主的间充质细胞，可使之不断分化为软骨细胞和成骨细胞 诱导新骨形成，提高了植骨材料的成骨活性；再次，本专利技术使用较温和的木瓜蛋白酶进行脱 蛋白处理，减少了对植骨材料中胶原蛋白和成骨因子的破坏，同时结合脱脂、脱钙、冷冻干燥协助降低抗原性，最大限度地保留了成骨活性。由于加强了对成骨诱导因子和胶原蛋白的 保护，本专利技术制备的牛皮质骨植骨材料植入动物骨缺损处后伤口未见明显渗液，无感染发生; 组织学观察淋巴细胞、单核细胞浸润较少；植入动物肌肉内可见异位成骨迹象，说明该材料具有低抗原性、较好的成骨诱导能力、更好的生物力学强度和生物相容性，既可以作为骨缺 损的充填材料，又可以复合各种成骨因子、种子细胞以构建组织工程骨。此外，本专利技术的制 备方法步骤简单、用料来源广泛、成本低，在今后的骨移植医学领域及临床骨缺损的修复上 具有广阔的应用前景。 具体实施例方式实施例一种本专利技术的牛皮质骨植骨材料，通过以下方法制备得到-(1) 取材及洁净处理清洁条件下，取检验合格(经疯牛病毒原检测)宰杀6小时内的 小牛(1~3岁)的长管状骨，用电锯锯去两侧干骺端，骨刀去净周围软组织、骨膜及骨髓，最 后用电锯切割成约长3mmx宽3mmx高5 mm大小皮质骨块；用40'C 5(TC温水将牛皮质骨块表 面的脂肪和血迹冲洗干净，沥干；(2) 脱脂在可密闭的玻璃容器中盛入氯仿与甲醇体积比为1 : 1的氯仿-甲醇混合溶液 (简称脱脂液)，将洁净处理后的牛皮质骨块按骨液体积比约1 : 3放入玻璃容器内并在室温下浸泡，浸泡脱脂过程中每隔4小时用无菌玻棒搅拌3~5分钟，每12小时更换一次脱脂液， 直到更换后的脱脂液经一段时间脱脂后颜色仍然澄清为止(浸泡时间约为72小时)；更换脱 脂液时用蒸馏水冲洗净容器内的软组织残渣，并将骨块置入离心机内离心约30分钟(3000 转/分)以清除骨块内脂滴；脱脂完毕后用蒸馏水反复冲洗牛皮质骨块至无氯仿、甲醇气味， 再用蒸馏水透析24小时，以去除残留的有机溶剂，最后沥干；(3) 脱钙将脱脂后的牛皮质骨块放入盛有0.6mol/L盐酸的可密闭容器中，在4'C环境 下浸泡脱钙20小时，期间每12小时更换一次盐酸；浸泡脱钙后用蒸馏水漂洗牛皮质骨块至 pH值接近中性，以使其接近人体生理的pH值水平，然后沥干；(4) BMP的稳定化将脱钙后的牛皮质骨块放入盛有1Ommol/L的N-乙基马来酰亚胺 溶液的容器中，室温下浸泡30小时，沥干；(5) 脱蛋白处理将BMP稳定化后的牛皮质骨块放入盛有木瓜蛋白酶溶液(酶溶液可现 配现用)的密闭容器中脱蛋白，木瓜蛋白酶溶液的pH值控制在7.0左右，每克牛皮质骨块用500u的木瓜蛋白酶进行处理，骨液体积比控制在i : 3，然后将密闭容器放入恒温水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛皮质骨植骨材料的制备方法，包括以下步骤：将洁净后的牛皮质骨块先进行脱脂、脱钙，再将其放入骨形态发生蛋白降解酶的抑制剂中浸泡，然后再经脱蛋白处理，最后经冷冻干燥后制得牛皮质骨植骨材料。

【技术特征摘要】
1、一种牛皮质骨植骨材料的制备方法，包括以下步骤将洁净后的牛皮质骨块先进行脱脂、脱钙，再将其放入骨形态发生蛋白降解酶的抑制剂中浸泡，然后再经脱蛋白处理，最后经冷冻干燥后制得牛皮质骨植骨材料。2、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述骨形态发生蛋白降解酶的抑制剂为 N-乙基马来酰亚胺溶液，其浓度为6 12mmol/L。3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述N-乙基马来酰亚胺溶液中浸泡 的时间为24~48小时。4、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述脱蛋白处理主要是指将牛皮质骨块 浸泡于木瓜蛋白酶溶液中进行脱蛋白，每克牛皮质骨块需要300 900u木瓜蛋白酶进行处理， 所述木瓜蛋白酶溶液的pH值控制在5.0~7.5，牛皮质骨块与木瓜蛋白酶溶液的体积比控制在 1 : (1~6)。5、 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于在木瓜蛋白酶溶液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡懿郃，董松庚，刘华，
申请(专利权)人：胡懿郃，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]