组织特异表达启动子及其获得方法和应用技术

本发明专利技术涉及组织特异表达启动子及其获得方法和应用。本发明专利技术首次通过筛选分离到一些多核苷酸，所述的多核苷酸在与启动子连接后，可指导下游的目的基因特异性地表达在植物的胚、胚乳或种子中，可应用这些多核苷酸来调控植物组织中基因的表达，从而实现植物品种改良。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及组织特异表达启动子及其获得方法和应用。
技术介绍
启动子是指基因中一段能准确有效起始基因转录的DNA序列，通常位于基因上游。启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子(转录因子)相互作用来调控基因转录的水平及其时空表达的特异性。目前使用最广泛的组成型启动子是烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子。同时，人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子并初见成效，肌动蛋白(Actin)和泛素(WDiquitin)等基因的启动子已被克隆。Mariani等成功地利用烟草花药绒毡层特异表达基因启动子TA^驱动核酸酶 Barnase, RnaseTl基因在花药中特异表达，破坏绒毡层，获得雄性不育油菜，这是首次通过基因工程创造出雄性不育系。小麦叶中表达ipt基因，提高细胞分裂素含量，可使叶绿素降解减缓，叶衰老变慢。水稻种子中富含谷蛋白(Glutelin)，分析发现GluB，GluD均在种子中特异表达。对GluB启动子区的详细分析还鉴定了决定其表达特异性的GCN4等核心元件。 以往已经利用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动八氢番茄红素合酶基因PSY，在水稻胚乳中成功合成了本不存在的β胡萝卜素(维生素A原)；也利用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加，而且促使铁蛋白主要在胚乳中而不是本来的糊粉层积累。然而，目前为止分离得到的水稻种子特异启动子并不多，并集中于谷蛋白基因家族。传统的获得启动子元件的方法往往存在通量低，针对性差，工作量大等缺点，而随着测序技术的发展，许多植物的全基因组序列已经测序完成，生物芯片技术的进步以及生物信息学分析方法的完善使人们能够从基因组学层面对植物基因的表达模式有一个全面的了解，而不是像以往只能局限于有限的基因。Haberer等通过对拟南芥和油菜基因组水平同源基因启动子区的种间序列分析，利用类似的生物信息学方法得到了 384个新的顺式元件，并检测到了大部分的已知转录调控序列的存在，证明了该方法的可行性。而目前，尚未见有基因组层面寻找水稻种子特异启动子(调控序列)或增强子的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供组织特异表达启动子及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO :1、 SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 或 SEQ IDNO :6 任一所示。在本专利技术的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于与启动子或启动子片段操作性连接，调控目的基因在植物组织特异性表达；其中，所述的启动子片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点。在另一优选例中，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的胚乳中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID N0:USEQID N0:2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4任一所示。在另一优选例中，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的胚中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。在另一优选例中，所述的多核苷酸与启动子或启动子片段操作性连接，驱动目的基因在植物的种子中特异性表达，其核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。在另一优选例中，所述的植物是具有胚、胚乳和/或种子结构的植物。在另一优选例中，所述的植物是被子植物；较佳地，所述的植物是单子叶植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。在本专利技术的另一方面，提供一种用于调控目的基因在植物组织特异性表达的构建物，所述构建物依次具有如下元件(5’ 一3’ ):(多核苷酸_X)n，启动子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQID NO :3、 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 6 任一所示；其中，η为1-100的正整数；较佳地，η为1_50的正整数；更佳地为1_30的正整数； 如 η 可以为 2，3，4，6，8，10，12，16，20 ；其中X为无，或长度在I-IOObp ；较佳地l_50bp，更佳地l_20bp，更佳地l-10bp，更佳地l-5bp，如2、3bp的核酸；其中，启动子的片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点。在一个优选例中，所述的启动子或其片段含有TATA-盒结构。在另一优选例中，所述的启动子选自(但不限于)烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子，或烟草花叶病毒(CaMV) 35S基本启动子(CAMV35S mini promoter)。在另一优选例中，所述的烟草花叶病毒35S基本启动子具有SEQ ID NO :27所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的构建物的启动子或其片段下游还包括一目的基因。在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。在另一优选例中，所述的目的基因序列位于所述启动子序列的下游，且是与所述的启动子序列直接邻近的编码基因的序列。通常，所述的核酸序列与目的基因序列的间隔小于IOOObp (优选的，小于500bp ；更优选的，小于200bp ；更优选的，小于IOObp ；最优选的， 小于50bp)。在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)β_葡萄糖苷酶(GUS)基因、 改善稻米或种子品质相关的基因(如人乳铁蛋白基因、赖氨酸合成酶基因、beta胡萝卜素合成基因、直链与支链淀粉合成酶基因等)。在另一优选例中，所述的多核苷酸、启动子、目的基因可操作性地相连。在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。在本专利技术的另一方面，提供一种植物细胞(优选为非繁殖材料)，所述的细胞中含有所述的多核苷酸或所述的构建物。在本专利技术的另一方面，提供所述的构建物的用途，用于调控目的基因在植物组织特异性表达。在另一优选例中，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO :1、 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4任一所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的胚乳中特异性表达。在另一优选例中，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO 5 所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的胚中特异性表达。在另一优选例中，所述的构建物中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO 6 所示，该构建物用于驱动目的基因在植物的种子中特异性表达。在本专利技术的另一方面，提供一种调控目的基因在植物组织(胚乳、胚或种子中)特异性表达的方法，所述方法包括(1)提供一构建物(表达载体)，所述构建物依次具有如下元件(5’ 一 3’)(多核苷酸-x)n，启动子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDN0:USEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 或 SEQ IDNO :6 任一所示；η 为 1-100 的正整数；X为无，或长度在I-IOObp的核酸；其中启动子的片段具有该启动子的引发转录的必要位点及转录起始点；(2)将目的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种分离的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６任一所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛红卫，温碧清，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31