DGGE法在微生物快速分类中的应用制造技术

DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是该应用分别包括DGGE法在区分不同益生菌中的应用、DGGE法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用、DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用和DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用。本发明专利技术的优点是：方便、快捷，可于菌种鉴定前将相同微生物归于一类，大大减少了后继工作量，节省大量时间和金钱。此外，本发明专利技术尚可判断所区分菌在混合样品中是否占优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速区分不同微生物种类方法在生物领域中的应用，尤其涉及在益生菌产品、传统乳制品、葡萄酒、动物微生态制品及人体内DGGE法在微生物快速分类中的应用。
技术介绍
微生物研究中，经常需要对混合样品中分离出的诸多单菌进行分类和鉴定，以期了解该菌的生理特点和发酵性质，为进一步的实验奠定基础。一般而言，菌种鉴定主要包括形态学、分子生物学、生理学和生物化学、次级代谢产物、泛醌系统、脂肪酸组成、细胞壁组成和蛋白质组成等。通常，我们利用多种培养基(常用培养基或者选择性培养基)对样品中的微生物进行培养，根据其菌落形态和革兰氏染色将其进行大略判断，之后利用以上介绍的鉴定方法进行菌种鉴定。为了尽可能多地鉴定出样品中的不同菌株，我们一般会对所有筛选菌进行鉴定，工作量大，耗时长，金钱消耗甚巨。16S rDNA指纹图谱技术——变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)可以直接利用细菌rDNA或者rRNA对微生物进行表征，不但避免了传统方法中耗时的菌种分离，而且可以鉴定出无法利用传统方法分离出的菌种。DGGE技术最先是用于检测DNA突变的一种电泳技术，与基于分子量大小进行分离的琼脂糖电泳和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不同，它是基于PCR扩增子的序列特异性熔解温度进行分离的， 并且可以检测出序列中一个核苷酸的差异。1985年Muzyers et al]首次在DGGE中使用 “GC夹子”和异源双链技术，使该技术日臻完善。1993年Muzyers et al首次将DGGE技术应用于分子微生物生态学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异方面具有独特的优越性。 由于DGGE技术避免了分离培养的缺陷，直观地显现微生物区系菌群多样性，目前已经成为微生物菌群多样性和动态变化分析的常用工具。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种DGGE法在微生物快速分类中的应用，该技术可以将益生菌产品、传统乳制品、葡萄酒、动物微生态制品及生物体内分离的多株菌进行分类，使用方便快捷、准确且重复性好，为后继实验节约大量时间和金钱。DGGE重现性强、可靠性高、速度快、能够弥补传统方法分析微生物群落的不足，已成为现代微生物学领域一种重要研究手段。本专利技术利用DGGE技术灵敏度高、重复性强的特点，对单菌进行DNA提取，PCR扩增和DGGE检测，从而快速、准确地将同种微生物与其它微生物区别开来。而且，我们以原样品中微生物为标准，可以判断出样品中的优势菌和弱势菌。因为DGGE技术是一种半定量技术，如果想获得具体菌的名称，则需对特征性的片断进行割胶回收、测序，最终确定其归属。本专利技术是一种微生物分类鉴定前期处理技术，可以将同种菌划为一类，从而为后面菌种鉴定节约大量时间和金钱。本专利技术的成功，为DGGE技术在微生物生态学领域的应用提供了新思路。本专利技术是这样来实现的，DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是该应用分别包括DGGE法在区分不同益生菌中的应用、DGGE法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用、DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用和DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用。所述DGGE法在区分不同益生菌中的应用利用细菌通用引物，乳酸菌和双歧杆菌特异性引物对4株乳酸菌标准菌和3株双歧杆菌标准菌株保守区片段PCR扩增并进行 DGGE检测，结果表明，相同标准菌株优势条带在DGGE胶上出现的位置和条带数一致，不同标准菌株优势条带在DGGE胶上位置和条带数不一致，所述4株乳酸菌标准菌分别为鼠李糖乳杆菌ATCC53103、植物乳杆菌ATCC8014、唾液乳杆菌FBC05、嗜酸乳杆菌ATCC4356 ；所述3株双歧杆菌标准菌株分别为婴儿双歧杆菌ATCC15697、青春双歧杆菌Bi07、长双歧杆菌 NCC2705，其中长双歧杆菌NCC2705设置3个重复。所述DGGE法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用利用通用引物或种属特异性引物对传统发酵乳中筛选出的11株微生物进行PCR扩增，同时以传统发酵乳中微生物总菌DNA的PCR产物为对照，进行DGGE检测，结果表明，筛选得到的11株微生物属于 5 禾中不同菌，分另Ij为 Lacio办plantarum ATCC8014> Streptococcus thermophilus CICC6038> Lactobacillus paracasei ATCC25302> Bacillus cereus ATCC14579 禾口 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCCl 1842 ；与 viili 、菌所代表的DGGE 条带相比可知，份re/^ococciAs thermophilus CICC6038为viili中细菌中的优势菌，而 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC11842 为 viili 中乳杆菌属中的优势乳杆菌。所述DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用利用通用引物或种属特异性引物对葡萄酒中筛选出的7株微生物进行PCR扩增，同时以葡萄酒中微生物总菌DNA的 PCR产物为对照，进行DGGE检测，结果表明，筛选得到的7株微生物属于4种菌，分别为 Saccharomyces cerevisiae ATCC9763^Baci11us megaterium ATCC19213>Paenibacillus pasadenensis SAFN—007T 禾口如eier sp. ATCC 33308 ；与葡萄酒总菌所代表的 DGGE条带相比可知，SaccAarofflJ^e1S cerevisiae ATCC9763为葡萄酒中的优势菌。DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用利用细菌通用引物对动物微生态制剂中筛选出的6株微生物进行PCR扩增，同时以动物微生态制剂中微生物总菌DNA的 PCR产物为对照，进行DGGE检测，结果表明，筛选得到的6株微生物都属于Lacto如 plan tarum ATCC8014，且其为葡萄酒中细菌属的优势菌。本专利技术的优点是本专利技术方便快捷，可于菌种鉴定前将相同微生物归于一类，大大减少了后继工作量，节省大量时间和金钱。此外，本专利技术尚可判断所区分菌在混合样品中是否占优势。附图说明图1为特异性引物扩增得到乳杆菌、双歧杆菌PCR产物的琼脂糖电泳结果。图2为V3区通用引物扩增得到乳杆菌、双歧杆菌PCR产物的琼脂糖电泳结果。图3为特异性引物扩增得到的乳杆菌、双歧杆菌PCR产物的DGGE电泳结果。图4为V3区通用引物扩增得到的乳杆菌、双歧杆菌PCR产物的DGGE电泳结果。图5为V3区通用引物和乳杆菌特异性引物扩增得到PCR产物的琼脂糖电泳结果。图6为V3区通用引物PCR-DGGE结果。图7为乳杆菌特异性引物PCR-DGGE结果。图8为葡萄酒中通用引物PCR-DGGE结果。图9为动物微生态制剂中通用引物PCR-DGGE结果。图1中:L1,嗜热链球菌；L2,鼠李糖乳杆菌；L3,植物乳杆菌L4，唾液乳杆菌L5， 嗜酸乳杆菌Mla。乳杆菌Marker; Mbif本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．ＤＧＧＥ法在微生物快速分类中的应用，其特征是该应用分别包括ＤＧＧＥ法在区分不同益生菌中的应用、ＤＧＧＥ法在区分传统发酵乳ｖｉｉｌｉ中不同微生物的应用、ＤＧＧＥ法在区分葡萄酒中不同微生物的应用和ＤＧＧＥ法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏华，陈廷涛，许恒毅，徐锋，万翠香，汪孟娟，熊顺强，姜淑英，李祖旭，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：36