一种人血管eNOS基因启动子改构体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人血管eNOS基因启动子改构体及其制备方法和应用。本发明专利技术所述人血管eNOS基因启动子改构体的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明专利技术通过对人血管eNOS基因启动子进行改造，从根本上改变了eNOS基因固有的弱启动子特性，提高了eNOS基因启动子的基础转录活性和刺激转录活性，为阐明其功能和调控机制建立了有用的工具，在基因治疗领域具有潜在的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种人血管eNOS基因启动子改构体及其制备方法和应用。
技术介绍
人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)不仅参与了血压调整、血管通透性调节、防止白细胞粘附和血小板聚集等生理过程，而且涉及高血压、动脉粥样硬化性心脏病、血管狭窄和阻塞、缺血性脑卒中等诸多严重病理过程的发生和发展。eNOS基因在心血管内皮细胞中固有表达，越来越多的研究证明eNOS在有害因素存在下对维持血压自稳和血管完整性及张力必不可少，eN0S的表达异常在高血压、动脉粥样硬化、血管功能障碍相关性疾病的发生和发展中至关重要。目前有关人血管eNOS基因的研究主要聚焦于上调或下调eNOS活性的刺激因素，eNOS基因启动子中顺式调控元件的功能，eNOS基因多态性及eNOS基因表达的信号调控通路。传统认为eNOS基因主要对血管壁切应力刺激应答，之后发现很多刺激因素都能明显改变eNOS基因的表达，如缺氧、溶血磷脂酰胆碱、塞利洛尔、黄酮类化合物、非诺贝特、神经酰胺和氧化低密度脂蛋白等。尽管发现影响人血管eNOS基因表达的因素越来越多，但目前对它们如何上调或下调eNOS基因的表达却知之甚少。关于eNOS基因的多态性与相关疾病的潜在联系，有文献表明G894 — T多态性可导致所编码的氨基酸的GlM98Asp多态性，GlM98Asp的错义导致eN0S在此处的构象发生改变，由α-螺旋变为紧密折叠，由此推测此突变可能影响eNOS蛋白的功能，使NO 生成减少，导致血小板聚集性增强，白细胞向内皮黏附，平滑肌细胞增生等病理生理现象。有关eNOS基因表达的信号调控通路，新发现激活丝裂原活化蛋白激酶家族成员细胞外信号调节激酶ERK1/2信号通路可显著上调eNOS基因的转录活性。另一些刺激因素如溶血磷脂酰胆碱也可以通过激活c-jun氮末端激酶JNK信号通路上调eNOS基因的转录活性，而丝裂原活化蛋白激酶P38信号通路的活化则显著下调其活性，这种作用可被靶向 SiRNA沉默ρ38α基因而取消。Seiichiroffariishi等(1995)研究eNOS基因启动子顺式调控元件的功能，发现 SPl元件对转录活性起关键作用。SPl结合位点同时受到位于上游-203位点的GATA位点的调节，当GATA位点发生突变时，eNOS基因启动子的活性只是略微下降，但当SPl位点突变时会导致启动子活性急剧下降，提示GATA顺式调控元件只有在SPl位点完整时才能发挥作用。William C. Sessa等利用PCR点突变方法发现SPl和TATA元件决定了 eNOS启动子的基础转录活性，并得到FotulaKarantzoulis-Fegaras等和KatarzynaCieslik等的进一步证实。人血管eNOS基因在心血管内皮细胞中固有表达，在维持血管张力中起着重要作用，其低表达与血管功能障碍相关性疾病密切关联。可是，已知eNOS基因启动子结构本身缺乏核心启动子识别序列，即传统的TATA BOX和起始子，而依赖GC BOX结合SPl转录因子协助转录调控，导致无论其基础活性还是刺激活性都处于低水平，明显增加了探明其功能的难度，也使得其基因治疗难以推进。因此，基于上述发现SPl是维持eNOS基因启动子活性关键的理论，我们探索了在eNOS基因启动子合适位点插入关键调控元件以改造eNOS基因启动子结构从而从源头提高eNOS基因启动子活性的方法。迄今为止，国内外尚未见任何通过改造eNOS基因启动子的结构而增加其活性的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有的人血管eNOS基因启动子存在的活性较低等问题， 提供一种基础活性和刺激活性均明显提高的人血管eNOS基因启动子改构体。本专利技术目的通过以下技术方案予以实现本专利技术利用PCR插入序列突变技术为人eNOS基因启动子添加一个调控元件SPl的通用识别序列，以此来改造启动子结构，目的在于提高启动子的转录活性；通过氯化钴构建的 HUVEC-12细胞缺氧模型和双荧光报告系统完成启动子改构体的转染和检测，分析启动子及其改构体的转录活性变化，初步验证了改构体的功能(图1)。具体地，本专利技术包括如下技术方案一种人血管eNOS基因启动子改构体，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本专利技术所述人血管eNOS基因启动子改构体的制备方法包括如下步骤(1)根据eNOS基因启动子序列设计一对5’端相连方向相反的引物，所述eNOS基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述引物序列如SEQ ID N0:3 4所示；(2)通过PCR进行eNOS基因启动子的插入序列突变，所述PCR的反应体系如下 HIS. Ing/ μ L5 μ LdNIPs 各 2. 5mmol/L2μ L引物各 20 μ mol/L1 μ L10X缓冲液2. 5yL聚合酶 5U/yL0. 1 μ L灭菌三蒸水13. 5yL;所述 PCR 的反应程序为95°C 5min，(94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 5min)30 个循环，72°C 10min，4°C 24h ；经过上述步骤，得到人血管eNOS基因启动子改构体。本专利技术所述人血管eNOS基因启动子改构体为阐明人血管eNOS基因启动子的功能及其调控机制提供了有用的工具。人血管eNOS基因启动子为一种弱启动子，目前为止，用于研究的刺激因素或方法仅能使eNOS基因启动子的活性轻度升高，因而难以通过观察其活性的变化来说明某种内源或外源因素的影响以及揭示这种影响的内在过程和规律，导致 eNOS基因启动子的功能及其调控机制的研究明显滞后于NOS家族的其它成员。另一方面， 已知在血管功能障碍相关性疾病中，eNOS基因的固有表达通过机体代偿机制而上调，但不足以抵消病理性损害因素的侵袭。外源刺激因素的作用又极其有限，如果能从基因调控的源头根本上提高eNOS基因启动子的活性，必将使血管功能障碍相关性疾病的基因治疗成为可能，因此，本专利技术通过制备得到人血管eNOS基因启动子改构体，可以用于制备治疗血管功能障碍相关性疾病的药物。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果(1)对人eNOS基因启动子传统的研究方法是通过启动子全长不同区域的序列删除或在顺式调控元件上作点突变，以探明该启动子中固有的哪一部分序列和调控元件在决定该启动子的活性中起关键作用，即目的在于阐明它们的作用或功能。与之相比，本专利技术利用插入序列突变技术在适宜的位置上为eNOS基因启动子添加关键的调控元件，从决定基因活性的源头上提高eNOS基因启动子的基础转录活性和刺激转录活性，这为研究eNOS基因启动子的转录调控机理和基因治疗的探索提供了一种新的工具或方法。因此，无论是研究思路和策略、技术和方法、目的和意义都完全不同；(2)结果表明，改造后的启动子转录活性有所提高，其基础转录活性达到了原启动子的 2. 3倍，在转染HUVEC-12细胞的同时添加氯化钴刺激的环境下，改构体转录活性依然保持较原启动子更高的转录活性；而且改构体能导致HUVEC-12细胞释放NO的含量升高。这些结果提示我们利用插入序列突变技术巧妙插入调控元件序列以提高人eNOS基因启动子活性的方法和技术具有明显的应用价值。附图说明图1为本专利技术人eNOS基因启动子改构体的结构改造流程图2为人eNOS基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种人血管ｅＮＯＳ基因启动子改构体，其特征在于其核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邢飞跃，樊振华，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81