本发明专利技术涉及通过敲除phrC基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM-T为骨架构建一个基因敲除载体pCSF-EM，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC9943基因组phrC基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB25。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过敲除MrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物
技术介绍
枯草芽孢杆菌OfeCiBm ·5油^Vi1S)是目前公认的安全微生物之一，其抗菌代谢产物丰富多样，尤其是脂肽类抗菌物质，不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能，因此不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。枯草芽孢杆菌(feci/^Assubtil is) ATCC 9943 是一种可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌月太物质的枯草芽孢杆菌(Val6rie Leclere, Romain Marti, Max Bechet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483)。其中，surfactin作为一种生物表面活性剂，与化学表面活性剂相比，其具有拥有生物降解能力，低毒，结构丰富的优点，随着对工业原料的环境适应性要求的提高， 其应用于环境保护，石油开采方面潜力将会越来越大。但实际中，其并未在工业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是因为它生产成本巨大，所以提高其产量便成为降低其生产成本的核心问题。目前，世界范围内，提高其产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化发酵条件， 而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。但随着对抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。基因(Gene ID: 937009)，其表达产物枯草杆菌感受态芽孢因子(CSF)是枯草杆菌中十分重要的调控蛋白之一，在枯草芽孢杆菌各种生理代谢过程中发挥着重要的作用，相关研究表明，CSF蛋白对于抗菌物质的合成具有一定的阻碍作用。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM_T 为骨架构建一个基因敲除载体pCSF-EM，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB 25。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是利用分子生物学技术，构建祐rC基因敲除载体，经过电转化通过同源重组将枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中基因敲除，从而构建一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 25。技术方案1、通过敲除祐rC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于 (1)/^rC基因敲除载体pCSF-EM的构建根据枯草芽孢杆菌/^rC基因设计引物WirC5’ -F和WirC5’ -R,以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分5，端/^rC基因及其上游基因，获得500bp基因片段；根据枯草芽孢杆菌/^rC基因设计引物WirC3，-F和WirC3，-R,以枯草芽孢杆菌ATCC 9943 基因组DNA为模板PCR扩增部分3’端祐rC基因及其下游基因，获得500bp基因片段；根据pMUTIM的DNA设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIM质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得850bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至 PMD19-T载体，转化大肠杆菌(fecAericAia coli) DH5a,经验证、测序正确后，分别命名为 VCSF5' -T、vCSF3' -T、ρΒΜ~ ,于 _20°C条件下保存备用；权利要求1.通过敲除祐rC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于 (1)/^rC基因敲除载体pCSF-EM的构建设计引物 PhrC5，-F 和 PhrC5，-R，以枯草芽孢杆菌 UaciBw1S subtil is、KKL 9943 基因组DNA为模板PCR扩增部分5’端MrC基因及其上游基因，获得500bp基因片段；设计引物WirC3，-F和WirC3，-R,以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分3， 端WirC基因及其下游基因，获得500bp基因片段；设计引物EM-F和EM-R，以pMUTIM质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得850bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至PMD19-T载体，转化大肠杆菌(Mscherichia coli ) DH5a,经验证、测序正确后，分别命名为VCSF5，-T、VCSF3' -Τ、ρΒΜ~ ,于_20°C条件下保存备用；名称序列酶切位点PhrC5， -F5 ‘ GAATTCCATGGCCCAAGCAGAACAAAMGCC3 ‘EcoRIPhrC5， -R5 ‘ TCTAGACATGAAAGTCGAGTGCTTCCGCAT3‘XbaIPhrC3， -F5 ‘ MATCTAGATAAGAACAAGCCCCTTCTCATTAG3‘XbaIPhrC3， -R5 ‘ ACAGCATGCTTTATATCACCTTCATATAGCCG3‘SphIEM-F5 ‘ TGATCTAGATAGAAGCAMCTTAAGAGTGTGT3 ‘XbaIEM-R5 ‘ TGATCTAGAMTTATTTCCTCCCGTTMATAAT3 ‘XbaIvCSF5f~l用EcoRI/XbaI双酶切后获得phrC5，六啟,与经过相同双酶切处理的pGEM_T 载体，用T4 DNA连接酶连接，构建载体，酶切验证正确后于_20°C条件下保存VCSF3f -T用XbaI/SphI双酶切后获得phrC3 "片段，与经过相同双酶切处理的 ^m~phrC5'载体，用"Γ4 DNA连接酶连接，构建pGEM-/7ArC载体，酶切验证正确后于_20°C 条件下保存备用；P^F-T用XbaI酶切后获得涨片段，与经过相同酶切处理的pGEM-/7ArC载体，用T4 DNA 连接酶连接，构建/^rC基因敲除载体pCSF-EM，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；(2) FMB 25突变菌株的构建以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的祐rC基因敲除载体pCSF-EM转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组/^rC位点发生双交换，红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为FMB 25 ；该菌株的祐rC基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了祐rC基因的突变菌株，即为所得到的菌株。2.权利要求1所述方法获得的敲除基因菌株FMB25。3.权利要求2所述敲除MrC基因菌株FMB25在生产枯草芽孢杆菌抗菌肽中的应用。4.用权利要求2所述敲除MrC基因菌株FMB25生产的枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。全文摘要本专利技术涉及通过敲除phrC基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物
本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM-T为骨架构建一个基因敲除载体pCSF-EM，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌AT本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．通过敲除ｐｈｒＣ基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：（１）ｐｈｒＣ基因敲除载体ｐＣＳＦ－ＥＭ的构建设计引物ＰｈｒＣ５’－Ｆ和ＰｈｒＣ５’－Ｒ，以枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ ９９４３基因组ＤＮＡ为模板ＰＣＲ扩增部分５’端ｐｈｒＣ基因及其上游基因，获得５００ｂｐ基因片段；设计引物ＰｈｒＣ３’－Ｆ和ＰｈｒＣ３’－Ｒ，以枯草芽孢杆菌ＡＴＣＣ ９９４３基因组ＤＮＡ为模板ＰＣＲ扩增部分３’端ＰｈｒＣ基因及其下游基因，获得５００ｂｐ基因片段；设计引物ＥＭ－Ｆ和ＥＭ－Ｒ，以ｐＭＵＴＩＮ４质粒为模板ＰＣＲ扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得８５０ｂｐ基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至ｐＭＤ１９－Ｔ载体，转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ，经验证、测序正确后，分别命名为ｐＣＳＦ５’－Ｔ、ｐＣＳＦ３’ －Ｔ、ｐＥＭ－Ｔ，于－２０℃条件下保存备用；名称序列酶切位点ＰｈｒＣ５’－Ｆ５’ＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＧＣＣ３’ＥｃｏＲＩＰｈｒＣ５’－Ｒ５’ＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＧＴＧＣＴＴＣＣＧＣＡＴ３’ＸｂａＩＰｈｒＣ３’－Ｆ５’ＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＡＴＴＡＧ３’ＸｂａＩＰｈｒＣ３’－Ｒ５’ＡＣＡＧＣＡＴＧＣＴＴＴＡＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＡＴＡＧＣＣＧ３’ＳｐｈＩＥＭ－Ｆ５’ＴＧＡＴＣＴＡＧＡＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴ３’ＸｂａＩＥＭ－Ｒ５’ＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＴＴＡＡＡＴＡＡＴ３’ＸｂａＩｐＣＳＦ５’－Ｔ用ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ双酶切后获得ｐｈｒＣ５’片段，与经过相同双酶切处理的ｐＧＥＭ－Ｔ载体，用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接，构建ｐＧＥＭ－ｐｈｒＣ５’载体，酶切验证正确后于－２０℃条件下保存备用；ｐＣＳＦ３’－Ｔ用ＸｂａＩ／ＳｐｈＩ双酶切后获得ｐｈｒＣ３’片段，与经过相同双酶切处理的ｐＧＥＭ－ｐｈｒＣ５’载体，用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接，构建ｐＧＥＭ－ｐｈｒＣ载体，酶切验证正确后于－２０℃条件下保存备用；ｐＥＭ－Ｔ用ＸｂａＩ酶切后获得ＥＭ片段，与经过相同酶切处理的ｐＧＥＭ－ｐｈｒＣ载体，用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接，构建ｐｈｒＣ基因敲除载体ｐＣＳＦ－ＥＭ，酶切验证正确后，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，用于下一步转化；（２）ＦＭＢ ２５突变菌株的构建以枯草芽孢杆菌ＡＴＣＣ ９９４３制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的ｐｈｒＣ基因敲除载体ｐＣＳＦ－ＥＭ转化入枯草芽孢杆菌ＡＴＣＣ ９９４３，在基因组ｐｈｒＣ位点发生双交换，红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为ＦＭＢ ２５；该菌株的ｐｈｒＣ基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了ｐｈｒＣ基因的突变菌株，即为所得到的菌株。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，曹国强，吕凤霞，别小妹，张充，钟蕾，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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