一种叶酸受体介导的pH敏感性Decoy-ODN纳米粒制剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种叶酸受体介导的pH敏感性Decoy-ODN纳米粒及其制备方法。以Decoy-ODN作为基因药物，采用叶酸偶联三甲基壳聚糖为药物载体，加入pH敏感材料，通过复凝聚法制备出纳米粒混悬液；原料组成如下：Decoy-ODN溶液浓度为5～200μg/ml，叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液浓度为0.01～6.0mg/ml，pH敏感材料溶液浓度为10～500μg/ml，叶酸偶联率为5％～30％，Decoy-ODN溶液及pH敏感材料溶液总体积与叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液体积比1∶(1～4)。本发明专利技术叶酸受体介导的pH敏感性Decoy-ODN纳米粒成型较好，粒径分布均一，DNA结合率高，制剂稳定性较好，细胞毒性较低，体外转染率较高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种叶酸受体介导的PH敏感性Decoy-ODN纳米粒制剂及其制备方法， 属于医药应用

技术介绍
近年来，随着基因转移技术的日趋成熟，基因治疗已经成为生物科学和临床医学的研究热点之一，并逐步成为治疗癌症的一种新手段。所谓基因治疗指的就是通过基因转移技术将人正常基因或有治疗作用的DNA序列导入人体靶细胞，通过控制目的基因的表达，抑制、校正、替代或补偿缺陷或异常基因，以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗手段。然而，肿瘤的发生与发展是一个多种基因参与、多环节、多阶段、多步骤的复杂过程。所以仅仅干预一个肿瘤相关基因很难达到治疗癌症目的。近年来，一些转录因子被逐渐发现，它们在调节多个肿瘤相关基因方面起重要作用。换句话说，这些转录因子可以看作是肿瘤发生和发展的总开关。因此，靶向性阻断某个转录因子治疗肿瘤越来越受到人们的关注，也逐渐成为治疗癌症的一个新策略。信号传导和转录活化因子3 (STAB)是细胞信号传导通路JAK2/STAT途径的关键转录因子，存在于胞浆，参与调节胚胎发育，细胞的正常生长、分化和恶变等过程。持续活化的STAT3能够调控许多肿瘤发生的环节，包括细胞周期， 凋亡，肿瘤血管形成及肿瘤细胞逃逸免疫系统等。因此它被看作癌基因。已有报道证明通过抑制STAT3能诱导肝肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖，打破肿瘤免疫的耐受状态。人工合成的 20-30bp双链DNA片段(Decoy-ODN)，其序列与STAT3欲结合的DNA区相同，且与转录因子有高亲和力。Decoy-ODN被导入目的细胞后，可作为“诱骗”顺式作用元件与靶基因顺式作用元件竞争结合转录因子，使正常活化的核转录因子被耗竭，改变核转录因子所调控靶基因的表达，从而使肿瘤细胞凋亡。但是裸基因进入细胞后容易被机体或细胞中的酶降解，且转染效率低，无法有效地实现治疗作用。所以开发安全、高效的基因转染体系是基因治疗的关键问题之一。目前应用的基因载体都存在转染效率低或者即便转染效率高，但存在免疫原性和潜在的致癌性。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种叶酸受体介导的PH敏感性Decoy-ODN纳米粒制剂及其制备方法。术语说明复凝聚法将基因药物Decoy-ODN、载体材料及pH敏感材料分别溶于缓冲液中， 于50 55°C水浴一定时间，将药物溶液与pH敏感材料溶液混合后于涡旋条件下逐滴滴入到载体材料中，继续涡旋，室温孵育一段时间即得本专利技术的叶酸受体介导的PH敏感性 Decoy-ODN纳米粒制剂。Decoy-ODN 诱骗寡核苷酸。FA:叶酸。TMC:三甲基壳聚糖。SlOO 聚丙烯酸树脂SlOO。CMC:羧甲基壳聚糖。HA:透明质酸。TE 缓冲液10mM Tris-HCl+lmM EDTApH8. 0。本专利技术是由如下技术方案实现的一种叶酸受体介导的pH敏感性Decoy-ODN纳米粒制剂，以Decoy-ODN作为基因药物，采用叶酸偶联三甲基壳聚糖为药物载体，加入PH敏感材料，通过复凝聚法制备出纳米粒混悬液；Decoy-ODN用TE缓冲液稀释得浓度为5 200 μ g/ml的Decoy-ODN溶液，叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液浓度为0. 01 6. Omg/ml，叶酸偶联率为5% 30%，pH敏感材料用磷酸盐缓冲液稀释得浓度为10 500 μ g/ml的pH敏感材料溶液，所述Decoy-ODN溶液及pH 敏感材料溶液总体积与叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液体积比1 (1 4)。所述的pH敏感材料为下列之一或它们的组合聚丙烯酸树脂SlOO (SlOO)，羧甲基壳聚糖(CMC)或透明质酸(HA)；优选聚丙烯酸树脂SlOO (SlOO)。所述的Decoy-ODN溶液及pH敏感材料溶液体积优选比例为1:1。将Decoy-ODN溶液与pH敏感材料溶液混合后，于50 55°C水浴20_30min，涡旋条件下滴入到叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液中，继续涡旋20-60s，室温孵育30min-;3h，即得叶酸受体介导的PH敏感性Decoy-ODN纳米粒制剂。本专利技术的叶酸受体介导的pH敏感性Decoy-ODN纳米粒制剂，优选的原料组成为Decoy-ODN溶液浓度50 μ g/ml,叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液浓度1. 2mg/ml、叶酸偶联率为10%，聚丙烯酸树脂SlOO溶液浓度100 μ g/ml ；Decoy-ODN溶液及聚丙烯酸树脂 SlOO溶液总体积与叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液体积比1 3。或者，Decoy-ODN溶液浓度25 μ g/ml、叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液浓度3. Omg/ml、叶酸偶联率为15 %，羧甲基壳聚糖溶液浓度300 μ g/ml ；Decoy-ODN溶液及羧甲基壳聚糖溶液总体积与叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液体积比1 1。或者，Decoy-ODN溶液浓度50 μ g/ml,叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液浓度1. 5mg/ml、叶酸偶联率为15%，聚丙烯酸树脂SlOO溶液浓度200 μ g/ml ；Decoy-ODN溶液及聚丙烯酸树脂 SlOO溶液总体积与叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液体积比1 4。本专利技术的叶酸受体介导的pH敏感性Decoy-ODN纳米粒制剂的制备方法，步骤如下(1)取Decoy-ODNJnA 0. ImlTE缓冲液充分溶解，稀释成浓度为5 200 μ g/ml, 即得Decoy-ODN溶液A ；(2)取叶酸偶联三甲基壳聚糖，用蒸馏水溶解后稀释成浓度为0. Ol 6. Omg/ml, 即为叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液B ； (3)取pH敏感材料，用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为10 500 μ g/ml，为溶液C ； (4)将Decoy-ODN溶液A和溶液C混合后得药物溶液D，与叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液B分别于50 55°C水浴20-30min，涡旋条件下将药物溶液D逐滴滴入到载体材料溶液B中，继续涡旋20-60s，室温孵育30min-;3h，即得叶酸受体介导的pH敏感性Decoy-ODN 纳米粒制剂。本专利技术的特点及优良效果叶酸受体靶向是近年来一种备受关注的新型抗肿瘤机制，而叶酸对叶酸受体具有高度的亲和性，故可利用这一特性将叶酸作为抗肿瘤药物的靶向配体，利用叶酸受体在某些肿瘤部位的过度表达，而在正常组织低水平表达的特性而实现叶酸偶联药物的靶向输送。而三甲基壳聚糖是壳聚糖的一种季氨化衍生物，便于修饰，无毒，生物相容性好，可通过表面带电荷的季氨基团与DNA分子主链上带负电的磷酸基团产生静电作用形成复合物，而且三甲基壳聚糖可以通过打开细胞间的紧密连接促进细胞的内吞作用，提高基因的转染效率。所以可利用叶酸的靶向性，选择壳聚糖为基质来制备叶酸靶向纳米载体作为基因载体。 另外，利用内涵体内的酸性环境，可在处方中加入PH敏感材料，实现基因药物的有效释放， 避免药物被溶酶体降解。因此本专利技术的叶酸受体介导的PH敏感性Decoy-ODN纳米粒是在传统纳米粒的基础上所制备的一种多功能基因载体，旨在实现基因安全、高效的转染，提高基因治疗作用。目前，基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。其中，病毒载体虽然具有较高的基因传递效率，但其临床应用存在安全性问题，如致突变、潜在的致癌性及免疫源性。因此研制非病毒载体传输系统成为另一重要的发展方向。纳米粒基因载体是近年来发展起来的一种新型的非病毒基本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种叶酸受体介导的ｐＨ敏感性Ｄｅｃｏｙ－ＯＤＮ纳米粒制剂，其特征在于：以Ｄｅｃｏｙ－ＯＤＮ作为基因药物，采用叶酸偶联三甲基壳聚糖为药物载体，加入ｐＨ敏感材料，通过复凝聚法制备出纳米粒混悬液；Ｄｅｃｏｙ－ＯＤＮ用ＴＥ缓冲液稀释得浓度为５～２００μｇ／ｍｌ的Ｄｅｃｏｙ－ＯＤＮ溶液，叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液浓度为０．０１～６．０ｍｇ／ｍｌ，叶酸偶联率为５％～３０％，ｐＨ敏感材料用磷酸盐缓冲液稀释得浓度为１０～５００μｇ／ｍｌ的ｐＨ敏感材料溶液，所述Ｄｅｃｏｙ－ＯＤＮ溶液及ｐＨ敏感材料溶液总体积与叶酸偶联三甲基壳聚糖溶液体积比１∶（１～４）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：翟光喜，陈焕蕾，张建，赵丽霞，李涛，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88