一种单一型黑色素及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种单一型黑色素及其制备方法和在药品及化妆品中的应用：本发明专利技术一是以1，8-二羟基萘为原料在酸性条件下与NaNO2作用得到的黑色粉末即为粉末二羟基萘－黑色素（DHN-melanin）；二是以1，8-二羟基萘在真菌DaldiniaeschscholziiIFB-TL01胞外粗蛋白的催化下得到片状的DHN-melanin。得到的两种形态的黑色素均有较强的羟基自由基清除活性。本发明专利技术可以用在化妆品中起抗氧化和射线、清除自由基的作用，可以用在染发剂中起装饰作用，也可用在生物杀虫剂方面起光保护剂的作用，适用于药品及化妆品等生物医药技术领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种黑色素及其合成方法和在药品及化妆品中的应用。
技术介绍
黑色素(melanin)是不溶于水和几乎所有溶剂的无定形小颗粒，黑色素广泛存在于动植物和微生物中的非均质的类多酚聚合体。目前天然黑色素的提取主要是用动物组织 (乌骨鸡、章鱼等)、植物(黑米、黑芝麻等)、微生物(产黑色素放线菌、真菌等)。黑色素的应用广泛，能作为紫外线吸收剂、抗氧化剂、自由基清除剂、阳离子螯合剂和新型天然的药物载体，也可用来治疗某些与黑色素缺乏有关的神经系统疾病。另外，黑色素在化妆品、染发剂的装饰作用以及生物杀虫剂的光保护剂等方面有着广阔的应用前景。早在1%4年Commoner在研究蛙卵的黑素组织工作中就提出黑素可以俘获自由基，并把他们稳定在黑素基质中，亦即说明黑色素中含有自由基。电子顺磁共振(Electron Paramagnetic Resonance，EPR)的工作原理是未成对电子在外加磁场中吸收微波辐射会改变电子自旋的状态，所以Era波谱可以用来检测自由基是否存在、自由基浓度、顺磁性物质的电子顺磁共振光谱及证明自由基的结构，波峰大小代表未成对电子含量的多寡。由于黑色素不溶于水和其他的有机容易，不能用核磁共振等技术测定其复杂的结构，而红外光谱anfrared Spectroscopy, IR)可以测试固态的样品，且测试迅速，操作方便，重复性好，灵敏度高。顶能够提供许多关于官能团的信息，可以帮助确定部分乃至全部分子类型及结构，常用来测定黑色素等固态样品。目前已知的黑色素是复合型黑色素，尚未见单一型黑色素的报道。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是公开一种单一型黑色素及其制备方法和在药品及化妆品中的应用。本专利技术所述黑色素的特征是黑色的高分子聚合物，不溶于水、强酸和其他有机溶剂，微溶于强碱，EI5R测试显示其含有1，8-DHN自由基。本专利技术所采用的技术方案是一是以1，8_ 二羟基萘为原料在酸性条件下与等摩尔的NaNOJt用，产物过滤后沉淀用乙酸乙酯洗三次，得到的黑色粉末即为粉末状 DHN-melanin。二是以1，8-二羟基萘为原料在pH5的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液中加入真菌TLOl胞外粗蛋白(含有漆酶)进行催化，反应液用乙酸乙酯萃取，水相/有机相界面有不溶物，收集不溶物，分别用水、甲醇漂洗，晾干后得到片状DHN-melanin。一、粉末状DHN-melanin的制备方法(1)将1，8-DHN加入酸性缓冲液中，搅拌，(2)搅拌过程中不断加入NaNO2至等摩尔，室温搅拌半小时，(3)将反应产物过滤，得到的沉淀分别用乙酸乙酯、甲醇、水漂洗两次，(4)沉淀自然晾干，经过EI3R测试、IR测试、电镜观察证实为粉末DHN-melanin。二、片状DHN-melanin的制备方法(1)硫酸铵浓缩法制备真菌IFB-TLOl(Maldinia eschscholzii IFB-TL01，现保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为=CCTCCM 207198，保藏日期是2007. 12. 13)胞外粗蛋白，利用ABTS法测定粗蛋白中含有漆酶等氧化酶，(2)粗蛋白的最适pH在5，在IOmlpH5的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中加入5 mg 1， 8-DHN、200U 的粗蛋白，28°C，180 rpm 反应 8 h,(3)将反应液用乙酸乙酯萃取，有机相/水相界面有不溶物，将不溶物收集，分别用甲醇、水漂洗两次，晾干后得到片状黑色固体，经过EI3R测试、顶测试、电镜观察证实为片状 DHN—melanin。melanin的EPR测试说明片状DHN-melanin相对粉末状DHN-melanin含有较多的自由基。电镜结果显示粉末状DHN-melanin是不均一的颗粒，大小在400-1200 nm之间；片状DHN-melanin是不规则片状。本专利技术的有益效果体现在公开了一种单一型的黑色素的制备方法，可以用在化妆品中起抗氧化和射线、清除自由基的作用，可以用在染发剂中起装饰作用，也可用在生物杀虫剂方面起光保护剂的作用。附图说明图1为粉末状DHN-melanin的电镜照片图2为粉末状DHN-melanin的EI3R测试3为粉末状DHN-melanin的顶测试图图4为片状DHN-melanin的电镜照片图5为片状DHN-melanin的ESR测试6为片状DHN-melanin的顶测试图。具体实施例方式通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本专利技术。但它们不是对本专利技术的限定。实施例1 粉末状DHN-melanin的制备方法1)将1，8-DHN慢慢加入柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH5.0 )中，搅拌，2)搅拌过程中不断加入IM的NaNO2溶液至等摩尔，室温搅拌半小时，3)将反应产物过滤，不溶物分别用乙酸乙酯、甲醇、水漂洗两次，4)沉淀自然晾干，经过EI3R测试、IR测试、电镜观察证实为粉末DHN-melanin。实施例2 硫酸铵浓缩法制备真菌eschscholzii IFB-TL01胞外粗蛋白真菌IFB-TLOl在PDA平板上活化，将新鲜的菌体块接种到1 L锥形瓶中，每瓶含有400mL的ME培养基，接种5 - 6瓶于摇床上，在150 — 200 rpmJ8°C条件下培养4天后，将菌体过滤，菌液在4°C，10，000 rpm离心20 min出去残留菌丝体；菌液中缓慢加入硫酸铵，使其终浓度为80%(每升菌液加入516g硫酸铵)，4°C下磁力搅拌器搅拌过夜使蛋白充分沉淀； 4°C下10，OOOrpm离心20 min后去除上清；沉淀用适量柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解(滤纸过滤除去不溶物)；置于透析袋中透析；之后将酶液进行冻干成褐色粉末。实施例3 真菌IFB-TLOl胞外粗蛋白酶活测定参照Robort Bourbounais方法，以3-乙基苯并噻唑_6_磺酸(ABTQ为底物，测定酶对其的氧化速率。具体方法为反应在室温下进行，总反应体积为3 ml，包括0.5 ml 0.5 mmol/L ABTS和1. 5 ml 0. 1 mmol/L柠檬酸，添加1 ml发酵液，在420 nm下测定其吸光值的变化，酶的单位定义为每分钟酶液吸光值增加量Δ 0D420/ (ml. min)，证明TLOl胞外粗蛋白有漆酶(或氧化酶)活性。实施例4 片状DHN-melanin的制备方法1)硫酸铵浓缩制备的粗蛋白的最适PH在5，在IOmlpH5的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中加入 5 mg 1，8-DHN、200 U 的粗蛋白，28°C，180 rpm 反应 8 h，2)将反应液用乙酸乙酯萃取，有机相/水相界面有不溶物，将不溶物收集，分别用甲醇、水漂洗两次，晾干后得到片状黑色固体，经过EI3R测试、顶测试、电镜观察证实为片状 DHN—melanin。实施例5 两种melanin的· OH自由基清除活性测定1)所需溶剂=CuSO4溶液，1. 14 mmol/ L ；苯甲酸溶液，0. 925 mmol/ L ；抗坏血酸(AA)， 0. 97mmol/ L溶液(使用前配制)；磷酸盐缓冲溶液，pH7. 40。2)在IOmL的试管中依次分别加入5. 00 mL pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液，0. 30 mL 1.14 mol/ L CuSO4 溶液，1.20 L本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种单一型黑色素，其特征是黑色的高分子聚合物，不溶于水、强酸和其他有机溶剂，微溶于强碱，ＥＰＲ测试显示其含有１，　８－ＤＨＮ自由基，红外光谱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭仁祥，汪伟，宋雅男，沈薇，宋勇春，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84