一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法，该方法利用RT-ARMS-qPCR方法检测乙肝病毒YMDD耐药突变。本发明专利技术采用序列特异性引物和荧光染料SYBRGreenⅠ进行扩增，实现了反应的实时监测，缩短检测时间，简化了操作步骤，而且不需要扩增后的分析过程，减少了产物污染的可能，与Taqman探针需双标记方法比较，SYBRGreenⅠ不需要设计合成荧光探针，简化了设计思路，成本较低。并结合熔解曲线分析，具有反应的特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法。
技术介绍
抗病毒治疗是慢性乙型肝炎治疗的关键，最终的目标是最大程度抑制HBV复制， 减少肝硬化、肝细胞癌、肝功能失代偿，延长生存期，提高生活质量。核苷酸类似物能阻断 HBV DNA的合成，抑制病毒复制，而拉米夫定是HBV治疗广泛应用的核苷类似物，能显著降低血清中HBV DNA的水平，并可使ALT正常化和肝组织学改善。但长期服用拉米夫定进行抗病毒治疗易出现HBV的YMDD基序发生突变，导致耐药的产生，称为YMDD变异。YMDD变异使患者体内病毒复制出现反弹，病情加重。因此，及早、尽快的检测出YMDD突变对患者实施个体化治疗方案具有重要意义。此外，YMDD的突变不是一蹴而就的，由于乙肝病毒的准种特点，YMDD的发生是一个在抗病毒药物的选择压力的作用下不断累积并最终表现为对核苷类似物的耐药的过程。提高突变型DNA的检测灵敏度，及早发现YMDD耐药的出现，可以尽早更换抗病毒药物，避免耐药的发生。YMDD变异即HBV逆转录酶的保守序列YMDD中M (蛋氨酸)被V (缬氨酸)或被I (异亮氨酸)所取代，是一种点突变。目前YMDD变异的分子生物学检测方法很多，然而，这些方法在临床实践中费时、技术要求高、对YMDD突变的检测灵敏度不高、检测费用昂贵，无法实现突变DNA的定量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法。该方法可定量检测YMDD的耐药突变YVDD，且特异性强、检测灵敏度高，耗时短、成本较低。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下本专利技术的一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法，利用RT-ARMS-qPCR方法检测乙肝病毒YMDD耐药突变。所述RT-ARMS-qPCR方法为根据乙型肝炎病毒基因序列的YMDD区域设计ARMS弓丨物；分别构建野生型和突变型质粒；以STOR Green为荧光检测信号，在ARMS引物的存在下，以构建的质粒为标准品，建立标准曲线，对野生型YMDD和突变型YVDD模板进行定量。所述引物为共同引物 KF :5’-TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC-3’ 野生型下游引物 MR :5，-CCC AAff ACC AVA TMA TCC AT-3’ 突变型下游引物 VR :5，-CCC AAff ACC AVA TMA TCC GC-3’ ； 其中M代表A或C ;K代表G或T ;W代表A或T ;V代表G或A或C。所述RT-ARMS-qPCR的反应体系和反应条件为采用25 μ L的反应体系，2倍浓缩的 SYBR Premix Ex Taq 12. 5 μ L，引物对20 μ M各0. 4 μ L，50倍浓缩的 ROX Reference Dye 0. 5 μ L，HBV DNA模板2 μ L，dH20 9. 2 μ L ；于ΑΒΙ7000荧光PCR仪进行反应并检测，PCR反应条件95°C 30s，然后按95°C 5s,61°C 31s，进行40个循环，荧光检测在60°C。制备出高质量的标准品是实时荧光定量PCR技术能否准确定量模板的基础和关键。将PCR产物克隆到质粒载体上(TA克隆)，优点是重组质粒稳定，质粒标准品纯化方式简单，易于定量测定和大量扩增、纯化和保存，是实时荧光定量PCR中最常使用的定量标准品。本专利技术首先对已经鉴定为野生型YMDD和突变型YVDD的标本，通过PCR扩增得到363bp 大小的DNA片段，将其与pMDIS-T载体进行TA克隆，构建出含PCR产物片段的重组质粒， 经PCR初步鉴定和预期结果吻合，核苷酸序列测定显示插入的片段序列与Genbank报道的序列一致，说明我们已经成功构建了重组质粒，可以将其作为YMDD、YVDD定量的标准品，为 RT-ARMS-qPCR方法的建立奠定了基础。我们确定了优化的RT_ARMS-qPCR反应体系和反应条件，方法学评价结果显示，重复性较好，重复性实验可反应方法的精密度，一般要求重复性实验的精密度< 5%，本专利技术通过重复性实验发现，YMDD高、中、低浓度质粒标准品批内CV 值分别为1. 06%、1. 1 禾口 1. 71%，批间CT值为4. 88%，YVDD高、中、低浓度质粒标准品批内 CT值分别为0. 96%、1· 11%和1. 29%，批间CT值为2. 63%，均能够满足临床的要求。本专利技术的方法特异性好，只对与引物相对应的模板DNA有特异性扩增，对不相应的DNA和空白无扩增；线性范围宽，从IO1-IO8浓度的模板都有较好的线性范围。该方法简便、快速、可靠，可同时鉴别正常、纯合和杂合突变，可满足临床YMDD、YVDD和YIDD定量的需要。本专利技术的显著优点本专利技术采用序列特异性引物和荧光染料STOR Green I进行扩增，实现了反应的实时监测，缩短检测时间，简化了操作步骤，而且不需要扩增后的分析过程，减少了产物污染的可能，与Taqman探针需双标记方法比较，SYBR Green I不需要设计合成荧光探针，简化了设计思路，成本较低。并结合熔解曲线分析，具有反应的特异性。附图说明图 1 为 YMDD、YVDD 普通 PCR 电泳图谱，其中 Lane 1 :DNA Marker ；Lane 2-7 模板为YMDD野生型，Lane 8-10模板为YVDD突变型；Lane 2-4退火温度为60°C，Line 5-10退火温度为61 °C ；图2为质粒和菌落PCR电泳结果，其中Lanel =DNA Marker ；Lane2 =M质粒PCR产物； Lane3 :M 菌落 PCR 产物；Lane 4、5 :V 质粒 PCR 产物；Lane 6、7 :V 菌落 PCR 产物； 图3为野生型YMDD重组质粒的部分序列图； 图4为突变型YVDD重组质粒的部分序列图； 图5为YMDD定量标准品荧光定量PCR动力学扩增曲线图； 图6为荧光定量PCR定量标准曲线； 图7为YVDD定量标准品荧光定量PCR动力学扩增曲线； 图8为荧光定量PCR定量标准曲线；图9为YMDD荧光定量PCR检测下限，注最高稀释度(曲线a)为IO5Copies/μ 1、最低稀释度(曲线b)为IO1拷贝数/μ 1;图10为YVDD荧光定量PCR检测下限，注最高稀释度(曲线a)为IO5Copies/μ 1、最低稀释度(曲线b)为IO1拷贝数/μ 1;图11为RT-ARMS-qPCR定量检测YMDD的特异性；图12为RT-ARMS-qPCR定量检测YVDD的特异性；图13为YMDD批内重复性的荧光曲线，注从左至右依次为IO7拷贝数/μ 1、105拷贝数/μ1、103拷贝数/μ ；图14为YVDD批内重复性的荧光曲线，从左至右依次为IO7 copies/μ IUO5 copies/ μ1>IO3 copies/μ 1。具体实施例方式实施例1材料及试剂来源 大肠埃希菌DH5ci感受态细胞 pMD 18-T Vector 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒高纯质粒小量制备试剂盒 2XHotStart Taq PCR MasterMixSYBR Z. Premix Ex Taq X-Gal、IPTG、DMF1.引物的设计与合成 1. 1 ARMS实验原理主要原理是人为制造引物与模板间本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测乙肝病毒ＹＭＤＤ耐药突变的方法，其特征在于：利用ＲＴ－ＡＲＭＳ－ｑＰＣＲ方法检测乙肝病毒ＹＭＤＤ耐药突变。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：欧启水，商红艳，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：35