一种烟叶生化添加剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种烟叶生化添加剂（Van-1）及其制备方法和应用，属于烟用添加剂的技术领域。本发明专利技术所使用的菌株分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Van35；保藏编号为CGMCC?No.3411。该生化添加剂Van-1处理烟叶8个月后，能有效促进烟叶中大分子化合物含量的改变，如总糖和还原糖含量升高，总氮、烟碱、蛋白质和纤维素的含量有所下降；同时，烟叶中的致香成分的含量提高，烟叶的品质和自然醇化18～24个月的烟叶样品接近。生化添加剂Van-1有助于烟叶中化学成分之间的转化和致香成分的形成与积累，可有效地提高烟叶的醇化效果，缩短醇化时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于烟用添加剂的
，更具体地说，本专利技术涉及一种生化添加剂。同时，本专利技术还涉及所述添加剂的制备方法和在烟草工业中的应用。
技术介绍
烟草是一种以吸食为目的的特殊经济作物，其使用价值取决于它的品质。香吃味是评价烟叶品质的重要指标，优质烟叶要求烟香气质纯正，香气量充足，吃味醇和，余味舒适。烟叶从种植到卷制成卷烟产品是一个复杂的系统工程，期间需要经历打叶复烤、烟叶醇化等一系列步骤。其中，打叶复烤是解决收获烟叶品质上存在缺陷的基本方法，即将烟站收购的初烤把装烟(亦称原烟)运到复烤车间进行第二次烤制，将整片烟打制成一定规格的碎片烟，在打叶复烤过程中杀虫，促进青烟转黄，减轻刺激和杂气，并控制烟叶水分在11 % 13%范围内，防止烟叶在仓储过程中生虫霉变。现有技术中打叶复烤后的碎片叶经过机械打包后，需要堆放在烟叶醇化仓库内，在自然条件下贮存2 3年，通过自然醇化改善烟叶的抽吸品质。这种自然醇化方法由于烟叶过于干燥，会抑制附着于烟叶表面的有益微生物的生长，所需烟叶醇化时间过长，增加了仓储成本。虽然可以通过添加外源生物酶以缩短醇化时间，但由于外源生物酶的品种过于单一，造成香性物质的种类减少，香气自然感、层次感有所减弱。同时，这种添加外源生物酶自然醇化的生产方式，人工和酶制剂的成本较高，这些都使得现有生产方法周期过长，需要占用大量资金和库房，生产成本较高。如何克服上述问题，现有技术中尚无理想的解决办法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的生化添加剂。本专利技术的另一目的是提供所述生化添加剂的制备方法。本专利技术进一步的目的是提供所述生化添加剂在烟叶醇化中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。*除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为质量百分数。A.本专利技术提供了一种生化添加剂，该添加剂是通过对短小芽孢杆菌{Bacillus pumilus) Van35的发酵产物提取。本专利技术从烤烟叶面上分离到一株细菌Van35，鉴定结果表明该细菌属于短小芽孢杆菌，该菌株命名为(Bacillus卿ilus) Van35。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG);该中心地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号； 保藏日期2009年11月5日；保藏号为CGMCC No. 3411。短小芽孢杆菌Van35菌株的形态学和生理生化性质特征为菌体呈杆状，革兰氏阳性，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小存在于菌体中。菌落呈圆形，扁平无凸起，乳白色，有光泽，边缘不整齐。常规生理生化实验表明ND12是好氧菌，过氧化氢酶实验，VP实验，产H2S实验，明胶液化实验和卵磷脂酶实验曾阳性；水解淀粉实验，产NH3实验，甲基红实验，吲哚实验，水解脂肪实验和硝酸盐还原实验呈阴性。短小芽孢杆菌Van35的分子鉴定特征为利用通用引物20F (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 1500R (5，-GGTTACCTTGTTACGA CT-3，)，以短小芽孢杆菌Van35的基因组DNA作为模板扩增得到1500 bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的Van35菌株的部分16S rRNA基因序列1510 bp,该序列已经递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列索引号为(；似90547。B.本专利技术提供了一种烟叶生化添加剂的制备方法，该方法采用下述步骤(1)将短小芽孢杆菌(Apumilus) Van35扩大发酵培养；将50 mL液体种子培养基分装于250 mL三角瓶中，接种菌株Van35，于30°C振荡(180 r/min)培养24 h，得到液体种子。接种8%的液体种子于装有MO mL液体种子培养基的 1000 mL三角瓶中，于30°C振荡(180 r/min)培养M h，得到用于扩大培养的液体种子。(2)通过过滤或离心收集发酵液；然后，无菌操作将8%的液体种子接种到装有60 L液态产酶培养基的100 L发酵罐中， 于30°C静态培养36小时放罐。离心(8000 rpm, 20 min)收集发酵液。(3)通过硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白质，离心收集沉淀；按照发酵液体积加入硫酸铵(56%，w/v)，搅拌2 h，再次离心(8000 rpm, 20 min)收集沉淀(4)透析除去硫酸铵，即得所需的生化添加剂。把沉淀溶解在600 ml的PH7. 0磷酸盐缓冲液中，透析除去硫酸铵，得到Van35发酵提取物，该提取物即为生化添加剂Van-1。C.本专利技术提供了所述的生化添加剂作为烟叶醇化添加剂的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果。(1)本专利技术使烟叶的醇化时间较自然醇化有了大幅度的缩短，并且烟叶品质有了明显的提高。能有效促进烟叶中大分子化合物含量的改变，例如，总糖和还原糖含量升高。 而总氮、烟碱、蛋白质和纤维素的含量有所下降；同时，烟叶中的致香成分的含量提高，(2)烟叶醇化时间的缩短有助于烟草企业节约仓储空间和时间，提高了醇化车间的利用率，有利于烟草企业的加速发展。(3)本专利技术提供的生化添加剂是对传统技术的重要突破，能有效改善烟叶的醇化过程，使烟叶的品质得到了明显提高，同时，增加了烟叶的利用率。(4)本专利技术工艺简单、操作性、规范性及可控性强，原料易得，成本低，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。附图说明图1是本专利技术制备菌株Van35发酵提取物的工艺流程图。 具体实施例方式例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1——培养基的制备1)斜面保藏培养基(克/升，g/V)胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl5，琼脂15，用20% Na2CO3 调节 pH 8. 5，121° C 灭菌 20 min ；2)液体种子培养基(克/升，g/v)胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl5，用20% Na2CO3调节 pH 8. 5，121°C 灭菌 20 min ；3)液态产酶培养基(%):麸皮1.5，大豆蛋白胨1.5，干酪素1.0，CaCl20. 1%， K2HPO4 0. 1 %，KH2 PO4 0. 125%, MgSO4 · 7H20,0. 05%, FeSO4 0. 0004%, pH 8.0。121° C 灭菌20 min。——菌株Van35发酵提取物的制备如图1所示，主要包括种子培养、发酵、离心、硫酸铵沉淀等步骤。具体的流程如下先将50 mL液体种子培养基分装于250 mL三角瓶中，接种菌株 Van35，于30°C振荡(180 r/min)培养M h，得到液体种子。接种8%的液体种子于装有 240 mL液体种子培养基的1000 mL三角瓶中，于30° C振荡(180 r/min)培养M h，得到用于扩大培养的液体种子.然后，无菌操作将8%的液体种子接种到装有60 L液态产酶培养基的100 L发酵罐中，于30°C静态培养36小时放罐。离心(8000 rpm, 20 min)收集发酵液，按照发酵液体积加入硫酸铵(56%，w/v)，搅拌2 h，再次离心(8000 rpm, 20 min)收集沉淀，把沉淀溶解在600 ml的PH7. 0磷酸盐缓冲液中，透析除去硫酸铵，得到Van35发酵提取物，该提取物即为生化添加剂Van-Ι。经检测生化添加剂Van-I含有多种水解酶，包括淀粉酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种烟叶生化添加剂，其特征在于：该醇化添加剂是通过对短小芽孢杆菌　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）　Ｖａｎ３５的发酵产物提取得到；所述的短小芽孢杆菌保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．　３４１１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：段焰青，者为，王明锋，杨金奎，朱保昆，蒋举兴，张克勤，
申请(专利权)人：红云红河烟草集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：53