利用新型工程菌制备生物农药的方法技术

利用新型工程菌制备生物农药的方法，采用经人工诱变处理野生菌株而获得的苏云金杆菌新型工程菌ＴＳ１６为生产菌株，利用本发明专利技术所设计的发酵培养基和本发明专利技术所使用的工艺流程生产生物农药，具有产品质量稳定、效益高、性能可靠、使用效果好，对人畜无害、易于储存、运输和使用方便等特点，与现有市场产品相比，效价高、相对使用成本低。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

Method for preparing biological pesticide by using new engineering bacteria

Method of preparing biological pesticide using new engineering bacteria system, using the Su Yunjin model coli engineering bacteria TS16 was obtained by artificial mutation and wild strains for producing strains, cultivation of production process of biological pesticide use and the invention by fermentation designed by the invention has stable product quality, high efficiency, reliable performance, the use of the effect is good, the characteristics of harmless, easy storage, convenient transportation and use, compared with the existing products in the market, high titer, relatively low use cost. \ue5cf

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物农药的制备方法，特别是一种利用苏云金杆菌新型工程菌制备生物农药的方法。自从1938年在法国诞生第一个苏云金杆菌商品制剂Sporeine以来，苏云金杆菌制剂已在生产上取得了巨大的成功。我国的科学家于1955年从引进的商品制剂中分离出苏云金杆菌菌株，在实验室制备出菌粉用于防治玉米螟虫。今天，苏云金杆菌制剂的生产与应用在我国已取得了显著成果。由于苏云金杆菌制剂具有不污染环境、对人畜无毒、不伤害非靶标生物，且成本低、易于生产等许多优点，从而，确立了其在害虫生物防治中的主导地位。近几年，在人工构建工程菌的研究中，人们发现借助于物理、化学方法以及基因工程技术选育或构建新菌株，是改造自然菌株获得高效苏云金杆菌杀虫剂的捷径。Bhattacharya(2000年)用亚硝基胍(NTG)诱变处理获得高毒力苏云金杆菌突变株；英国和前苏联学者曾应用物理方法诱变选育到高效菌株；美国的公司把HD-1的某些质粒消除后得到比出发菌株毒力高2倍的菌株，并接合转移技术对其进行处理，获得了毒力比出发菌株高7.5倍的菌株；Ecogen公司于1995年就注册了以基因工程菌EG7673为生产菌株的微生物杀虫剂。目前，虽然国外在苏云金杆菌的研究中，有了很大的发展，但是真正在生产上应用的人工构建的工程菌还不多，在我国则更少。我国在人工构建工程菌方面也发表了不少文章，《生物工程学报》1999年4月(15卷2期)报道了“杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建”；《中山大学学报》1999年7月(38卷4期)报道了“利用转座子Tn917构建杀虫Bt工程菌”；《微生物学报》2001年2月(41卷1期)报道了“杀虫遗传工程荧光假单胞菌IPP202部分生物学特性”。以上的文章介绍了我国采用基因工程技术构建工程菌的实验室试验情况。常规的生物农药制备方法，其生产工艺是砂土管菌种→斜面活化→摇瓶考察→种子罐培养→发酵罐培养→过滤浓缩→吸附→喷雾干燥→质量检验→包装→成品入库。本专利技术的目的，是通过对野生菌株的人工诱变处理，获得高效、广谱的苏云金杆菌新型工程菌，利用新型工程菌投入生产，为农业生产增加一种新的生物农药。本专利技术的利用新型工程菌制备生物农药的方法，是利用从自然界中筛选分离的野生菌株，经人工诱变处理获得高效苏云金杆菌新型工程菌TS16(Bacillus thuringiensis，已于2002年3月14日送交位于北京市中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC0729)，以TS16为生产菌株，其生产工艺是砂土管菌种→斜面活化→摇瓶考察→种子罐培养→发酵罐培养→过滤浓缩→吸附→喷雾干燥→质量检验→包装→成品入库。一、培养基1、斜面活化培养基采用常规配方蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，琼脂2.5g/L；pH7.4～7.5，15磅灭菌30分钟。2、摇瓶考察培养基采用常规配方蛋白胨15g/L，酵母膏8g/L，葡萄糖5g/L，NaCl5g/L；pH7.4～7.5，15磅灭菌30分钟。3、种子罐培养和发酵罐培养都采用本专利技术设计的含有丰富碳源和氮源的发酵培养基，其单位容积所含的各种原料干物质重如下黄豆饼粉28～34g/L， 玉米粉10～18g/L，花生饼粉25～32g/L， 鱼粉10～16g/L，蛋白胨4～8g/L， 酵母粉1.5～4.5g/L，FeSO4.7H2O 0.02～0.06g/L， ZnSO4.7H2O 0.04～0.1g/L，CaCO30.1～1g/L。以上组成中黄豆饼粉、玉米粉、花生饼粉、鱼粉要求新鲜不发霉且过140目筛。二、发酵生产1、菌种斜面活化从冷藏处取出砂土管，将TS16菌株接入上述常规的斜面活化培养基中，30℃～32℃恒温培养70～75小时。肉眼观察菌苔正常，芽孢形成正常。2、摇瓶考察将活化的砂土管菌种悬液移入上述常规的摇瓶考察培养基中，180～200r/min30℃摇床培养10～12小时。显微镜观察菌体与染色正常，即可进入种子罐扩大培养。3、种子罐菌种扩大培养在种子罐配料槽中加入按上述发酵培养基配方称量好的原料，加水搅拌均匀、溶解后泵入种子罐，定容、灭菌前调pH值为8.3-8.6，然后按巴氏灭菌法灭菌，后将培养基冷却备用；在无菌条件下接入菌种，通入无菌空气，调节通风比为1∶0.9-1.2，操作罐压0.5公斤/厘米2，培养温度为28～32℃，搅拌速度200～300r/min，培养时间为12-14小时，镜检后可接入发酵罐进行发酵生产。4、发酵罐发酵培养采用气升式发酵罐，按上述发酵培养基配方配好原料后投入罐中，灭菌前调pH值为8.3～8.6，然后灭菌30～40分钟，冷却至30℃后备用。用压差法无菌接种，将种子罐内生长旺盛菌种按2～5％接种量接入发酵罐，然后调节空气量，保持通风比为1∶1.0-1.3，罐压为0.5公斤/厘米2，温度为29-32℃；发酵11～14小时后，通风比调节为1∶1.5-1.7，发酵搅拌功率为15kW，发酵周期为25-28小时。5、后处理放罐时，发酵液先由主发酵罐进入中间贮罐，而后进入超滤装置，循环过滤后，废液由废水沟排至废水处理池，浓缩后的发酵液注入吸附罐。然后，加入吸附剂，搅拌均匀，30分钟后泵至干燥塔进行喷雾干燥，干品水分小于4％，最后将成品原粉输送到制剂配制单元进行配制包装。采用本专利技术的利用新型工程菌制备生物农药的方法，其所需原料易得，配方合理，发酵效价高。本专利技术利用新型工程菌制备的生物农药产品，除对菜青虫、小菜蛾、稻纵卷叶螟、茶毛虫、茶尺蠖等敏感昆虫有效外，对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等非敏感害虫也有防治效果。产品质量稳定、性能可靠、使用效果好，且对人畜无害、易于储存、运输、使用方便。与市场现有的产品相比，具有效价高、相对使用成本低的特点，发酵生产试验的产品效价达37678IU/mg，为开展以菌治虫的害虫生物防治增加了一种新的生物农药。大田示范试验结果表明，产品在浓度为100μg/ml时，杀虫效果达90％以上。为了更充分公开本专利技术的利用新型工程菌制备生物农药的方法，下面结合实施例加以说明。一、培养基的配方1、斜面活化培养基蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，琼脂2.5g/L；pH7.4～7.5，15磅灭菌30分钟。2、摇瓶考察培养基蛋白胨15g/L，酵母膏8g/L，葡萄糖5g/L，NaCl5g/L；pH7.4～7.5，15磅灭菌30分钟。3、发酵培养基单位容积所含的各种原料干物质重如下黄豆饼粉32g/L、玉米粉14g/L、花生饼粉32g/L、鱼粉14g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉4.5g/L、FeSO4.7H2O0.04g/L、ZnSO4.7H2O0.08g/L、CaCO31g/L。黄豆饼粉、玉米粉、花生饼粉、鱼粉要求新鲜不发霉，且过140目筛。二、操作流程与技术参数1、菌种斜面活化从冷藏处取出TS16菌种，接入茄子瓶斜面活化培养基中，30℃恒温培养72小时。肉眼观察菌苔饱满、灰白色无杂菌、无空斑或针眼，显微镜观察97％以上芽孢、晶体脱落，未见营养体，晶体大且染色深。2、摇瓶考察将活化的砂土管菌种悬液吸取0.5ml移入上述的摇瓶培养基中(500ml三角瓶装50ml培养基)。200r/min30℃摇床培养10小时。显微镜观察菌体形状正常、生长一致、无杂菌，并处于对数本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用新型工程菌制备生物农药的方法，其特征是采用经人工诱变处理野生菌株而获得的苏云金杆菌新型工程菌ＴＳ１６（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，保藏号：ＣＧＭＣＣ ０７２９）为生产菌株，利用本专利技术所设计的发酵培养基和本专利技术所使用的工艺流程生产生物农药。

【技术特征摘要】
1.利用新型工程菌制备生物农药的方法，其特征是采用经人工诱变处理野生菌株而获得的苏云金杆菌新型工程菌TS16(Bacillusthuringiensis，保藏号CGMCC0729)为生产菌株，利用本发明所设计的发酵培养基和本发明所使用的工艺流程生产生物农药；2.根据权利要求1所述的利用新型工程菌制备生物农药的方法，其特征是，使用的发酵培养基，单位容积所含的各种原料干物质重如下黄豆饼粉28～34g/L， 玉米粉10～18g/L，花生饼粉25～32g/L， 鱼粉10～16g/L，蛋白胨4～8g/L， 酵母粉1.5～4.5g/L，FeSO4.7H2O0.02～0.06g/L， ZnSO4.7H2O0.04～0.1g/L，CaCO30.1～1g/L；3.根据权利要求1或2所述的利用新型工程菌制备生物农药的方法，其特征是，在种子罐菌种扩大培养过程中，灭菌前培...

【专利技术属性】
技术研发人员：关雄，邱思鑫，黄天培，吴永先，
申请(专利权)人：福建农林大学生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]