一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法技术

本发明专利技术公开了一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法，其步骤：A、将紫草干燥茎块烘干、用乙醇超声提取，超声，得到干浸膏；B、用溶剂石油醚和乙酸乙酯将乙醇干浸膏萃取，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏；C、将浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，蒸干至无乙酸乙酯气味，串联后的柱子接到中低压制备型色谱柱上；D、洗脱剂为石油醚，在中低压色谱柱的荧屏监控图下洗脱柱子，收集流份，得到化合物；E、将中低压制备色谱上串联，将化合物用甲醇溶解，化合物得纯化；F、化合物经过碱性反应产生紫色，无色亚甲蓝显色试验呈阳性。方法易行，操作简便，该方法是利用中低压制备色谱；高效分离抗癌活性成分的优化工艺，且含量在95%以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从药用植物中提取分离萘醌类成分的
，更具体涉及一种从紫草抗肿瘤活性成分-萘醌类的提取方法，这些活性成分不仅有抗肿瘤的作用，还有抗炎、解热、镇痛、镇静、抗病原微生物、抗生育作用、保肝等作用，能广泛用于医药卫生行业。
技术介绍
紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebaieuchroma (Royle) Johnst的干燥根，紫草中主要药效成分为萘醌类色素，包括紫草素、去氧紫草素、β，β 二甲基丙烯酰紫草素、乙酰紫草素等。从紫草中分离出萘醌类有效成分，其药理作用不仅有抗病原微生物作用；抗病毒作用；抗炎作用；消化道平滑肌的作用。主要有抗癌作用，由新疆紫草中提得的紫草素 (Shikonin)，510mg/kg可完全抑制腹水型肉瘤18(1细胞的生长。10mg/kg可延长带瘤小鼠生命92. 5%。紫草素(Shikonin)对小鼠肝癌H22和Lewis肺癌的放射增敏作用。目前，对紫草萘醌成分的提取纯化方法有较多的研究报道，但大多是传统的提取分离工艺，分离时间长，提取杂质多；溶剂耗损大；不易分离得到高纯度的药用成分。本专利提供的提取分离方法，是利用Dr Flash II型中低压制备色谱快捷、高效、量大的一种优良提取分离工艺，也能获得纯度较高的有效成分。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了，方法易行，操作简便，该方法是利用中低压制备色谱；高效分离抗癌活性成分的优化工艺，且含量在95%以上·。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术措施 ，其步骤是1、 将紫草干燥茎块烘干、粉碎后用乙醇超声提取，乙醇的倒入量为药材重量的5 10 倍。置入超声仪中超声3(T50min，再将超声后的物质过滤，回收过滤溶液中的溶剂。将回收的溶剂再倒入三角瓶，继续超声，重复本步骤3飞次，得到用乙醇提取的干浸膏。2、分别用溶剂石油醚和乙酸乙酯将乙醇干浸膏萃取，石油醚和乙酸乙酯的量为浸膏的4 7倍，反复萃取3 5次，至萃取液无色，分别将石油醚和乙酸乙酯萃取液过滤；回收过滤溶液中的溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏。3、将以上二种浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，用其1 3倍量的400-500目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯气味；取400ml、1500mL Flash柱(也可以用玻璃和不锈钢柱) 各一个，400ml的柱装拌样硅胶，1500ml的柱仅装硅胶作为分离柱。二根柱都干法上样；分别用石油醚洗脱至柱平衡，再将二根柱串联，串联后的柱子接到中低压(0.广5兆帕)制备型色谱柱上。中低压(0. Γ5兆帕)制备色谱柱的制备条件为泵压力100-200帕，流速IOOml/ min，检测器的监控波长为395nm，检测器的收集波长为280nm，死体积为7mL。4、洗脱剂为石油醚含B (B是按乙酸乙酯丙酮=4:1混合的溶剂)2% (v/v),6%(ν/ν), 10% (ν/ν) 的比例洗脱，每组洗脱剂中还加上0.2% (ν/ν)的甲酸，即，洗脱剂为1份 B加49份石油醚加0. 1份甲酸混合，在中低压(0. Γ5兆帕)色谱柱的荧屏监控图下洗脱柱子，并收集流份，按监控图出现的谱峰收集，再以薄层色谱(TLC)检识辅助，取TLC检测紫色斑点中Rf值一致的流份，合并流分后得到六个粗的化合物。5、将中低压(0. Γ5兆帕)制备色谱上串联的2根柱子换成C18柱、将六个粗品化合物分别用甲醇溶解，注入C18柱中，用不同梯度的甲醇-水洗脱，收集流分，蒸干，六个化合物得到进一步的纯化，经高压液相色谱检测六个化合物的质量分数为95%以上。6、六个化合物经过碱性反应产生紫色，无色亚甲蓝显色试验呈阳性，说明为萘醌成分(碱性反应的方法25% (WZV)Na2COyK溶液；4% (v/v) HCHO水溶液；5% (ν/ν)邻二硝基苯的苯溶液各1滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加热至温度在50 70°C，1 4分钟内产生紫蓝色。无色亚甲蓝显色试验，在薄层色谱TLC的板上用无色亚甲蓝溶液喷雾，板子上出现蓝色的斑点)。7经核磁共振谱、红外、质谱分析确证六个单体分别为去氧紫草素 (deoxyshikonin)、紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β -羟基异戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)；异丁酰紫草素(isobuytyrlshikonin), β , β 一二甲基丙烯酰紫草素(β，β 一 dimethylacrylshikonin)。并依次命名单体的化合物为 ZC I ；ZC II ；ZCIII ； ZCIV ；ZC IV ；ZC VI。经高压液相色谱测试，六个化合物的纯度分别是ZC I为99. 62% ；ZC II 为 99. 02% ；ZC III为 99. 5% ；ZC IV为 99. 31% ；ZC V 为 99. 3% ；ZC VI为 99. 2%。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果1)与现有的常压制备技术相比现有的制备色谱，大多数为常压制备色谱，常压制备色谱虽然有容易操作、方便，不要额外购买仪器，只要购买玻璃柱和展开剂等优点，但柱填充料的颗粒如硅胶一般在100 200目，分离效果差，大多数要2次或多次过柱，而且柱洗脱时间长，耗时耗力。而中低压(0.广5兆帕)制备色谱，柱填充料的颗粒细，如硅胶可以用 400 500目(颗粒细更容易分离单体)，在中低压立下，流速会大大加快，分离时间短，达到好的分离效果。2)与现有的高压制备技术相比高压制备色谱(10-30兆帕)中色谱柱的材料颗粒均很细一般为5微米，制备量有限.而且成本过高，目前只用于分离实验级的毫克的量。中低压(0. Γ5兆帕)制备色谱是可以制备100克级以上的单体，上样量大；运行成本低，仪器要求配置低，而且用戶可以自己裝柱；还可使用预装住，利用薄层色谱TLC可以快速的建立分离方法。3)常压制备色谱与环境直接连接，试剂容易挥发，污染环境，而中低压制备洗脱剂可以密闭循环使用，不会对环境污染。具体实施例方式一种紫草抗肿瘤活性成分_萘醌类的提取方法，其具体步骤是A、将Ikg紫草干燥茎块烘干、粉碎后用乙醇超声提取，乙醇倒入量为药材重量的5 10 倍。置入超声仪中超声30或34或39或44或47或50min，再将超声后的物质过滤，回收过滤溶液中的溶剂。将回收的溶剂再倒入三角瓶，继续超声，重复本步骤3或4或5次，得到用乙醇提取的干浸膏55g，得率为紫草干燥茎块重量的5. 5%。 B、分别用溶剂石油醚和乙酸乙酯萃取乙醇浸膏，萃取溶剂石油醚和乙酸乙酯的量为浸膏的4或5或6或7倍，萃取至液体无色，分别将石油醚和乙酸乙酯萃取液过滤；回收过滤溶液中的溶剂，得到石油醚萃取浸膏为Hg，乙酸乙酯萃取浸膏16. 5gC、将以上A、B步骤获得的二种浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，用其1或2或3倍量的400或450或500目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯气味；取400ml、1500mL Flash柱(也可以用玻璃和不锈钢柱)各一个，400ml的柱装拌样硅胶，1500ml的柱仅装硅胶作为分离柱。 二根柱都干法上样；分别用石油醚洗脱至柱平衡，再将二根柱串联，串联后的柱子接到中低压制备型色谱柱上。中低压(0. 1或0.5或1或2或3或4或5M bar)制备色谱柱的制备条件为泵压力100或150或2本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法，其步骤是：Ａ、将紫草干燥茎块烘干、粉碎后用乙醇超声提取，乙醇的倒入量为药材重量的５～１０倍，置入超声仪中超声３０～５０ｍｉｎ，再将超声后的物质过滤，回收过滤溶液中的溶剂，将回收的溶剂再倒入三角瓶，继续超声，重复本步骤３～５次，得到用乙醇提取的干浸膏；Ｂ、分别用溶剂石油醚和乙酸乙酯将乙醇干浸膏萃取，石油醚和乙酸乙酯的量为浸膏的４～７倍，反复萃取３～５次，至萃取液无色，分别将石油醚和乙酸乙酯萃取液过滤；回收过滤溶液中的溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏；Ｃ、将（Ａ）和（Ｂ）步骤的浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，用其１～３倍量的４００－５００目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯气味；取４００ｍｌ、１５００ｍＬ　Ｆｌａｓｈ柱各一个，４００ｍｌ的柱装拌样硅胶，１５００ｍｌ的柱仅装硅胶作为分离柱，二根柱都干法上样；分别用石油醚洗脱至柱平衡，再将二根柱串联，串联后的柱子接到中低压０．１～５兆帕制备型色谱柱上，中低压０．１～５兆帕制备色谱柱的制备条件为泵压力１００－２００帕，流速１００ｍｌ／ｍｉｎ，检测器的监控波长为３９５ｎｍ，检测器的收集波长为２８０ｎｍ，死体积为７ｍＬ；Ｄ、洗脱剂为石油醚含Ｂ：Ｂ是按乙酸乙酯：丙酮＝４：１混合的溶剂２％ｖ／ｖ，６％ｖ／ｖ，１０％ｖ／ｖ的比例洗脱，每组洗脱剂中还加上０．２％ｖ／ｖ的甲酸，洗脱剂为１份Ｂ加４９份石油醚加０．１份甲酸混合，在中低压０．１～５兆帕色谱柱的荧屏监控图下洗脱柱子，并收集流份，按监控图出现的谱峰收集，再以薄层色谱检识辅助，取ＴＬＣ检测紫色斑点中Ｒｆ值一致的流份，合并流分后得到六个粗的化合物；Ｅ、　　将中低压０．１～５兆帕制备色谱上串联的２根柱子换成Ｃ１８柱、将六个粗品化合物分别用甲醇溶解，注入Ｃ１８柱中，用不同梯度的甲醇－水洗脱，收集流分，蒸干，六个化合物得到进一步的纯化；Ｆ、六个化合物经过碱性反应产生紫色，无色亚甲蓝显色试验呈阳性，说明为萘醌成分：碱性反应的方法２５％ｗ／ｖＮａＺＣⅣ为９９．３１％；ＺＣⅤ为９９．３％；ＺＣⅥ为９９．２％。β－羟基异戊酰紫草素；异丁酰紫草素、β，β一二甲基丙烯酰紫草素，并依次命名单体化合物为ＺＣⅠ；ＺＣⅡ；ＺＣⅢ；ＺＣⅣ；ＺＣⅣ；ＺＣⅥ，经高压液相色谱测试，六个化合物的纯度分别是ＺＣⅠ为９９．６２％；ＺＣⅡ为９９．０２％；ＺＣⅢ为９９．５％；２ＣＯ３水溶液；４％ｖ／ｖＨＣＨＯ水溶液；５％ｖ／ｖ邻二硝基苯的苯溶液各１滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加热至温度在５０～７０℃，１～４分钟内产生紫蓝色；Ｇ、经核磁共振谱、红外、质谱分析确证六个单体分别为去氧紫草素、紫草素、乙酰紫草素、...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓，袁萍，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：83